Коэффициент компактности: Эффективность объема здания

Топ-10 прогнозируемых комплексов мотивов с рейтингом P -значение. ( Средний ) Ниже каждый комплекс мотивов, расположение лежащих в его основе отдельных мотивов обозначено красными и синими линиями.( Left ) Для каждого комплекса мотивов обогащенные типы клеток разделяются символами «+». Количество экземпляров комплекса мотивов в сверхчувствительных также указаны сайты, специфичные для каждого типа клеток. Значение P дается для наиболее значимого прогноза для указанных типов ячеек. ( Right ) Димер TF, который связывает комплекс мотивов, с цитированием в литературе.

В целом, 19 из 25 известных димеров TF (дополнительная таблица 1) присутствовали в наших прогнозах, что позволяет предположить, что наш метод имеет чувствительность 76%.Это число следует рассматривать как нижнюю границу, поскольку некоторые ТФ из набора известных димеров могут не экспрессироваться в типах клеток, рассмотренных в нашем исследовании. Примечательно, что наш 36-й комплекс мотивов, NFAT – AP-1 ( P = 2,1 × 10 ⁻⁴⁰ , http://bioputer.mimuw.edu.pl/papers/tfdimers/), соответствует NFAT – FOS– Тример JUN, который, как известно, синергетически регулирует несколько генов иммунного ответа (Chen et al. 1998b). Этот тример был предсказан нашим алгоритмом, потому что последовательность, распознаваемая димером FOS-JUN (AP-1), присутствовала в виде одиночный мотив (инвентарный номер M00926) в TRANSFAC.

Прогнозируемые взаимодействия значительно перекрывают предыдущие систематические проверки TF – TF

Чтобы проверить наши предсказания по совместному связыванию с экспериментальными данными в крупном масштабе, мы перекрыли их атласом. из 5238 человеческих белок-белковых взаимодействий (ИПП) между факторами транскрипции. ИПП были выведены из двугибридных млекопитающих. анализы и другие формы экспериментальных доказательств (Ravasi et al.2010). Важно отметить, что, даже если бы наши прогнозы были совершенно точными, можно было бы ожидать только их часть. присутствовать в наборе PPI, поскольку существующие экспериментальные методы имеют ограниченную чувствительность. Например, двугибридный Расчетная чувствительность анализа составляет 25% (Ravasi et al. 2010). Точно так же, даже если бы наши прогнозы охватывали каждое истинное взаимодействие, мы все равно ожидали бы, что они будут включать только часть PPI из-за ложных срабатываний в последнем.Например, уровень ложного обнаружения двугибридных млекопитающих анализ составляет ∼53%. Более того, только подмножество комплексов TF-TF в наборе PPI, вероятно, связывает ДНК с обеими субъединицами. Тем не менее, мы обнаружили очень значимое совпадение ( P = 1,2 × 10 ⁻⁸² ; см. Методы) с атласом.

Мы также сравнили наши прогнозы с кооперативными взаимодействиями, выведенными из анализа мотивов данных ChIP-seq (Whitington et al.2011). Мы сгруппировали 59 комплексов мотивов, специфичных для определенного типа клеток человека, о которых сообщили Whitington et al. (2011) точно так же, как наши комплексы были сгруппированы, и получили 44 неизбыточных прогноза. Из этих 44 предсказаний 29 были опубликованы. в типах клеток, для которых мы получили данные DNase-seq. Мы обнаружили, что девять из этих 29 (31%) также были предсказаны с помощью нашего метода. по крайней мере в одном типе клеток, и 7/29 (24%) были предсказаны нашим методом в точно таком же типе клеток (см. Методы).Таким образом, существует значительное ( P = 2,6 × 10 ⁻²³ ), хотя и неполное, перекрытие между двумя наборами прогнозов. Помимо ложных срабатываний и отрицательных результатов в двух взаимодействиях наборы, одной из возможных причин ограниченного перекрытия является то, что большинство димеров TF-TF, предсказанных Whitington et al. (2011) были предсказаны связывание в <30 местах генома. Наш метод, хотя и является более общим, чувствителен только к димерам TF – TF. с широко распространенным связыванием, поскольку он не выигрывает от точности данных ChIP-seq.Это различие подчеркивается наблюдение, что наши 603 предсказанных димера TF, по оценкам, связываются в 450 652 местах всего генома. Напротив, предсказания кооперативности ТФ человека в Whitington et al. (2011) охватывают 1821 геномный сайт.

Плотность разрезанной ДНКазы I независимо поддерживает предсказанные физические взаимодействия

При прогнозировании димеров TF мы не использовали всю информацию, содержащуюся в данных DNase-seq.В частности, мы проигнорировали вариации в высоте пика ДНКазы-seq – все гиперчувствительные участки считались эквивалентными. Следовательно, мы ожидаем ложноположительного комплексы мотивов должны быть распределены случайным образом относительно высоты пика. Напротив, действительно совместные комплексы мотивов должны показывают перекос в сторону «более высоких» пиков сверхчувствительности. Это связано с тем, что кооперативность усилит связывание ТФ-ДНК и, следовательно, повышают открытость хроматина в среднем (Boyle et al.2011; Pique-Regi et al. 2011). Это открывает еще одну возможность для независимой проверки наших прогнозов – мы могли бы проверить каждый предсказанный димер TF – TF на предмет склонность к более высоким пикам сверхчувствительности. Обратите внимание, что в этом подходе к валидации нет цикла, поскольку мы тестируем для перекоса высоты пиков в наборе сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I, а не между пиками и остальной частью генома.

Для иллюстрации снова рассмотрим комплекс мотивов AR – FOXA1.Мы предсказали, что AR – FOXA1 будет связываться кооперативно в 690 местах. внутри LNCaP-специфичных гиперчувствительных сайтов, причем два отдельных мотива смещены на 11 п.н. Мы построили среднюю плотность профиль ДНКазы I разрезает в кооперативно связанных местах путем агрегации по этим 690 сайтам (см. Методы). Для сравнения, мы рассмотрели 1909 экземпляров комплекса мотивов AR – FOXA1 с «неправильным» интервалом (смещение мотива между 12 и 21 п.н.) в пределах тот же набор гиперчувствительных сайтов.Если два TF действительно связываются кооперативно при предсказанном смещении мотива, эта кооперативность приведет к более сильному среднему связыванию TF-ДНК на сайтах с правильным расположением мотивов по сравнению с сайтами с неправильным интервал. Следовательно, мы ожидаем, что плотность разрезов будет больше на 690 правильно расположенных точках по сравнению с 1909 годом. неправильно расположенные сайты. Это действительно так в центральном окне в 200 п.н. (рис.3A) ( P = 1,3 × 10 ⁻¹³ ). Наше исследование профилей плотности разрезов других известных димеров ТФ показало ту же тенденцию (данные не показаны).

ДНКаза I сокращает плотность около предсказанных и неправильно расположенных комплексов мотивов. ( A ) Пример AR – FOXA1. Среднее количество разрезов ДНКазы I в LNCaP-специфичных гиперчувствительных сайтах показано поблизости. экземпляров комплекса мотивов AR – FOXA1.(Красная кривая) Плотность разрезания ДНКазы I, усредненная по 690 случаям предсказанного AR – FOXA1 motif комплекс (мы предсказываем, что гетеродимер AR-FOXA1 связывается в этих местах в клетках LNCaP). (Черная кривая) Плотность разреза DNase I усреднено по 1909 случаям неправильно расположенных комплексов мотивов AR-FOXA1 (шире, чем прогнозируемое расстояние на 1-10 п.н.). Плотность разрезания ДНКазы I значительно выше в пределах ± 100 п.н. от предполагаемых сайтов связывания гетеродимера.( B ) Аналогично A : плотность разрезания ДНКазы I, усредненная по 54 предсказанным комплексам мотивов, которые не продемонстрировали значительного обогащения ДНКазой. Я сокращаюсь при индивидуальном анализе (см. Методы).

Мы повторили сравнение профилей плотности разрезания ДНКазы I на рис. 3А для всего набора из 603 комплексов сигнатурных мотивов и обнаружили, что как группа они вместе показали ожидаемую плотность разрезов. обогащение ( P <10 ⁻³⁰⁰ ).На индивидуальном уровне 91% предсказанных кооперативных взаимодействий (549/603) показали статистически значимое обогащение. в DNase I сокращается после корректировки для множественного тестирования (FDR <0,05). Таким образом, большинство предсказанных нами димеров были независимо подтверждено тестом на плотность разреза.

Чтобы получить более полное представление об оставшихся 54 (603-549) предсказанных комплексах мотивов, которые были отвергнуты этим тестом, мы усреднили их общий профиль среза DNase I и сравнили его с профилем на 540, соответствующем неправильно расположенному комплексы.Обнадеживает то, что мы снова обнаружили значительное локальное повышение доступности ДНКазы I (рис. 3B) ( P = 0,019), предполагая, что более глубокое секвенирование библиотек DNase-seq может обеспечить достаточную статистическую мощность для проверки несколько дополнительных комплексов мотивов.

Эволюционное сохранение поддерживает предсказанные физические взаимодействия

Еще одним подходом к проверке предсказанных димеров TF было бы сравнение оценок эволюционной сохранности между предсказанными и неправильно расположенные комплексы мотивов.Этот тест имеет ограниченную мощность, поскольку известно, что сайты связывания TF очень быстро расходятся. между видами, а также потому, что информативные позиции в комплексах мотивов обычно охватывают только ∼5–10 п.н. Однако мы все еще ожидал, что по крайней мере некоторые из предсказанных нами комплексов покажут сигнал об эволюционной ограниченности; см., например, профиль ограничения гомодимера FOXA1 (HNF3A) (фиг. 4A). Для этой цели мы использовали баллы консервации приматов по парам оснований (Pollard et al.2010), взвешенных по содержанию информации о мотивах (см. Методы). Для 23,7% прогнозов (143/603) мы наблюдали преимущественный эволюционный ограничение (FDR <0,05), что еще раз подтверждает достоверность наших прогнозов (рис. 4B).

Сигнатуры эволюционных ограничений предсказанных комплексов мотивов. ( A ) Пример гомодимера FOXA1 (HNF3A), занимающий 11-е место и предсказанный для клеток LNCaP (рак простаты).Опять же, мы рассмотрели предсказанный комплекс мотивов (первый столбец) и его 10 неправильно расположенных вариантов. В каждом положении нуклеотида интенсивность цвета указывает средний балл ограничения phyloP, взвешенный по содержанию информации в соответствующей позиции мотива (см. Методы). Эволюционные ограничения максимальны при предсказанном интервале между мотивами. ( B ) Эволюционное ограничение q -значений и кратное изменение для 100 наиболее предсказанных комплексов мотивов.Баллы эволюционных ограничений были рассчитаны для каждого предсказанный комплекс мотивов и его 10 неправильно расположенных вариантов (см. Методы). Для каждого прогноза мы проверяли, соответствует ли соответствующий экземпляры комплекса мотивов были обогащены для эволюционных ограничений относительно оставшихся 10 интервалов. Покажем соответствующие q -значения ( верхний, ) и кратные изменения ( нижний ) оценок эволюционных ограничений между предсказанным комплексом мотивов и его неправильно расположенными вариантами.Прогнозы с q -значение ниже 0,05 обозначено синими полосами на обоих графиках.

Прогнозируемые кооперативные взаимодействия жесткие и компактные

В литературе существует некоторая неопределенность в отношении пространственных свойств пар мотивов, которые связаны димерами ТФ (Мирный 2010; Биггин 2011).Здесь мы определяем расстояние между мотивами как количество промежуточных нуклеотидов между краями двух мотивов (отрицательные значения указывают на перекрытие мотивов). Как отмечалось выше, многочисленные исследования проверяли нечеткое расстояние между мотивами и предсказывали взаимодействия TF-TF. с относительно большими расстояниями между мотивами (~ десятки пар оснований). Напротив, некоторые биохимические анализы предполагают, что димерные интервалы между мотивами должны быть жесткими или полужесткими, а также компактными (<5 п.н.).Известные комплексы ТФ, соответствующие этой схеме, включают: количество гетеродимеров SOX-OCT (Ng et al. 2012) и несколько димеров ядерных рецепторов (Umesono et al. 1991). Наши результаты четко соответствуют последней модели, что проиллюстрировано пространственным рисунком показателей обогащения комплекса мотивов, соответствующих к нашим 100 лучшим предсказаниям (рис. 5A). Обратите внимание, что для большинства из 603 предсказанных взаимодействий требуется полностью жесткий интервал, а подавляющее большинство остальных допускает только 1-2 п.н. вариации в расстоянии между мотивами (рис.5Б).

Жесткость и компактность димеров транскрипционных факторов. ( A ) Для каждого из 100 лучших прогнозов мы отображаем комплексное обогащение мотива P -значение как функцию расстояния между мотивами (см. Методы). Расстояние до слева красной линии соответствует перекрывающимся мотивам. ( B ) Очень немногие из 603 предсказанных комплексов мотивов остаются значительно обогащенными при изменении расстояния между мотивами, что позволяет предположить, что кооперативные мотивные комплексы жестко разнесены.( C ) Распределение интервалов предсказанных димеров мотива ( верхний ) и известных димеров TF ( нижний ; дополнительная таблица 1). Расстояние до слева красной линии соответствует перекрывающимся мотивам. Предсказанные и известные димеры компактны, т. Е. Расположены близко друг к другу.

Интересно, что подавляющее большинство (87,2%) интервалов между мотивами среди наших 603 предсказаний были отрицательными, что указывает на перекрытие мотивов. (Инжир.5С). Возможно, что такая высокая частота перекрытия просто представляет собой артефакт неинформативных пар оснований, присутствующих в боковые стороны мотивов TRANSFAC. Однако даже после обрезки потенциально избыточных позиций мотивов (см. Методы) мы по-прежнему обнаружили, что 67,8% пар мотивов перекрываются (Supplemental Fig. 4). Постоянно наблюдалась высокая степень перекрытия. даже среди пар обрезанных мотивов, соответствующих известным димерам ТФ (рис.5С; Дополнительная таблица 1). Таким образом, 87,2% ассоциаций, обнаруженных нашим подходом, будут невидимы для существующих методов, которые не допускайте наложения мотивов. Более того, даже после обрезки мотивов, что не обязательно рекомендуется во всех случаях, 67,8% наши прогнозы невозможно было бы обнаружить с помощью всех существующих подходов. В целом, наши результаты показывают, что димеры ТФ связывают жесткие и очень компактные комплексы мотивов.

Прогнозируемые кооперативные взаимодействия указывают на ключевую роль FOXA1 в клетках рака простаты

Как отмечалось выше, все 10 лучших предсказаний кооперативности совпадают с известными димерами TF (рис.2). Однако прогноз с 11-м рейтингом, который предполагает наличие гомодимера FOXA1 (HNF3A) в клетках рака простаты ( P = 5,1 × 10 ⁻⁹³ ) (рис. 6B), насколько нам известно, является новым. Этот димер мотива также показывает очень сильный сигнал преимущественного эволюционного развития. ограничение ( q = 5,2 × 10 ⁻¹⁸ ) (рис. 4A). Обратите внимание, что в той же клеточной линии рака простаты уже существует один хорошо известный димерный комплекс с участием FOXA1, а именно, AR – FOXA1 (Wang et al.2011), который занял шестое место среди наших прогнозов (рис. 6А). Вдохновленные этими двумя случаями, мы искали дополнительные кооперативные взаимодействия FOXA1 среди наших прогнозов. Поразительно, мы нашли второй предсказанный гомодимер FOXA1 с совершенно другой структурой (108-е место, P = 8,8 × 10 ⁻¹⁸ ) (рис. 6C), а также предсказанный гетеродимер FOXA1 – NFI (139-е место, P = 6,4 × 10 ⁻¹⁵ ) (рис. 6D). Таким образом, мы прогнозируем, что FOXA1 участвует по крайней мере в четырех сильных кооперативных режимах связывания димеров в клетках рака простаты, только один из которых был ранее известен.

Ключевая роль FOXA1 в клетках рака простаты (LNCaP). ( Left ) Наиболее важные предсказания кооперативности с участием FOXA1 и лежащих в основе сверхпредставленных комплексов мотивов. Количество экземпляров и P -значение показано на рисунке 2. ( справа ) Предсказанные трехмерные структуры соответствующих комплексов TF-TF-ДНК.( A ) Гетеродимер FOXA1 – AR; ( B ) расходящийся гомодимер FOXA1; ( C ) конвергентный гомодимер FOXA1; ( D ) Гетеродимер FOXA1 – NFI. Из-за отсутствия кристаллической структуры для NFI в PDB 3D-структура не прогнозируется в D .

Чтобы оценить, допускают ли димеры с четырьмя мотивами, включающие FOXA1, топологически сборку димерных комплексов TF, мы попытались для создания структурных моделей.С этой целью мы сначала смоделировали идеальные структуры B-ДНК, содержащие димерные мотивы из рисунка 6, с помощью сервера w3DNA (http://w3dna.rutgers.edu/). Затем мы загрузили структурные модели из Protein Data Bank (PDB) (Berman et al. 2000), содержащие рецептор андрогенов (Shaffer et al. 2004) и FOX (Littler et al. 2010) ДНК-связывающие домены (идентификаторы PDB 1R4I и 3G73. ) при связывании с последовательностями ДНК, которые близко соответствуют консенсусу наших композиционные мотивы. К сожалению, мы не нашли записей PDB с разумным сходством последовательности с NFI.Собрать гипотетический В тройных комплексах ТФ – ТФ – ДНК мы наложили нити ДНК экспериментальных кристаллических структур на смоделированную ДНК с составные мотивы с использованием метода наименьших квадратов, аппроксимирующего по Куту (Emsley and Cowtan 2004). Затем мы визуализировали полученные комплексы с помощью PyMOL (DeLano 2002).

Анализируя полученные модели димеров TF на ДНК, мы обнаружили, что как гомодимерные комплексы FOX, так и гетеродимерные Комплекс FOX – AR может собираться без каких-либо стерических затруднений.Более того, интерфейсы белков комплекса FOX-AR (Fig. 6A), а также конвергентный гомодимер FOX (Fig. 6C; Supplemental Fig. 5) расположены благоприятно, так что они могут участвовать в прямых межбелковых взаимодействиях. Расходящиеся Гомодимер FOX (рис. 6B) расположен на противоположных сторонах двойной спирали ДНК, и прямые межбелковые взаимодействия между ДНК-связывающими доменами менее вероятны в данной конформации, за исключением выраженных аллостерических эффектов.Возможно, что кооперативность связывания FOX – FOX в этом случае опосредовано конформационными изменениями ДНК, как ранее наблюдалось во многих случаях (Baburajendran et al. 2011).

Обсуждение

Сила нашего метода проистекает из того факта, что он, в принципе, может предсказать все комплексы TF в данном типе клеток на основе на одном наборе данных DNase-seq. Дополнительные наборы данных могут быть включены в будущем для прогнозирования димеров в дополнительных ячейках. типы.Судя по набору из 25 известных кооперативных димеров, наши предсказания имеют чувствительность не менее ∼76%. Подавляющее большинство из 603 предсказанных комплексов являются новыми. В целом, наши результаты показывают, что димеризация ТФ распространена гораздо шире, чем раньше. известный. Это дает по крайней мере частичное объяснение парадоксу специфичности связывания TF-ДНК в больших геномах. В то время как ТФ могут индивидуально обладать низкой селективностью последовательности, комплексы, которые они образуют с другими ДНК-связывающими факторами, могут иметь высокую специфический (Levine and Tjian 2003).Таким образом, наши результаты предполагают, что текущая биоинформатика сосредоточена на прогнозировании связывания ТФ с ДНК на основе индивидуального положения. весовые матрицы и данные об открытости хроматина должны быть расширены.

Мы систематически проверяли наши прогнозы кооперативности TF путем сравнения с крупномасштабной экспериментальной базой данных белок-белок. взаимодействий, и было обнаружено очень значительное совпадение. Это совпадение очень обнадеживает, учитывая глубокие различия. между нашим вычислительным методом и экспериментальными подходами.Наш метод опрашивает TF в их родной среде в нескольких типы клеток человека, тогда как экспериментальные методы, такие как двухгибридные анализы, измеряют взаимодействия между химерными, искусственно экспрессировал человеческие белки в одном типе клеток, отличных от человека. Еще одно важное отличие состоит в том, что двухгибридный анализ измеряет склонность белков к образованию контактов независимо от ДНК, тогда как наш метод специфически обнаруживает образование ТФ комплексы на геномной ДНК.Более того, двухгибридный анализ не учитывает тканеспецифичность изоформ TF, посттрансляционную модификации или потенциальное влияние кофакторов на кооперативное связывание.

Мы также использовали новый статистический тест для обнаружения локального повышения плотности тегов DNase-seq, который подтвердил 91% (549/603) предсказания и показали, что по крайней мере некоторые из оставшихся 54 предсказаний также были бы подтверждены, если бы соответствующие Библиотеки DNase-seq были секвенированы на большую глубину.Еще один показатель функциональной значимости предлагаемых комплексов. является преимущественным эволюционным сохранением пар мотивов с предсказанной структурой. Эти выводы независимо подтверждают точность прогнозов кооперативности TF.

FOXA1, как хорошо известно, действует как фактор-первопроходец в нескольких типах клеток, включая клетки рака груди и простаты (Zaret and Carroll 2011). Другими словами, FOXA1 может инициировать связывание даже на участках ДНК, закрытых нуклеосомами, и тем самым усиливать последующее связывание. других факторов.Таким образом, можно было бы представить, что FOXA1 должен быть способен связывать все совпадения своих мотивов в геноме человека. Однако это явно не так; в действительности, FOXA1 связывает только небольшую часть своих сайтов-кандидатов (Lupien et al. 2008). Таким образом, должен быть какой-то другой механизм, который компенсирует ограниченную способность открытости хроматина обеспечивать связывание. специфика на пионерские ТФ. Наши результаты предполагают, что множественные гомодимерные и гетеродимерные способы связывания потенциально могут вносят вклад в специфичность связывания FOXA1.В качестве альтернативы можно было бы предположить, что димеризация может повысить способность этого фактора-пионера, чтобы конкурировать с нуклеосомами, когда родственная ДНК-связывающая поверхность недоступна. Интересно, другие известные факторы-первопроходцы, такие как GR и GATA (Zaret and Carroll 2011), также входят в число наших 40 предсказанных взаимодействий, предполагая, что димеризация потенциально может представлять собой общий механизм специфичности для новаторских ТФ.

Предыдущие исследования были сосредоточены почти исключительно на нечетком разнесенном ко-связывании TF, что в целом указывает на функциональную или косвенную кооперативность . Напротив, биохимические исследования показывают, что только один интервал между мотивами или самое большее два-три интервала, совместимы с прямой кооперативностью посредством димеризации TF (Grove et al. 2009; Cotnoir-White et al. 2011; Slattery et al.2011). Более того, даже когда видно, что TF димеризуется на нескольких различных возможных расстояниях, одно расстояние обычно преобладает с точки зрения аффинности связывания. Например, хотя OCT4 и SOX2 могут димеризоваться по парам мотивов, разделенных ровно тремя дополнительными пары оснований относительно канонического расстояния между мотивами OCT4-SOX2, каноническое расстояние явно обеспечивает большую аффинность связывания (Нг и др., 2012 г.). Поэтому неудивительно, что сайты связывания in vivo в подавляющем большинстве поддерживают канонический интервал (Chen et al.2008 г.).

Наши результаты показывают, что существует большой класс конформационно ограниченных димеров TF, которые связывают жестко разнесенный мотив. комплексы. Негибкость этих комплексов мотивов означает, что димеризация ДНК часто налагает строгие ограничения. от относительной пространственной конформации участвующих ТФ. Как и в случае с OCT4 и SOX2, небольшое количество дополнительных расстояния между мотивами действительно могут обеспечивать альтернативные режимы связывания димеров для тех же факторов, но эти дополнительные режимы, вероятно, иметь более низкое сродство, а также вносить относительно небольшое количество сайтов связывания генома.Наконец, наши предсказанные комплексы мотивов обычно очень компактны, что, возможно, предполагает, что димеризация ТФ чаще опосредуется ДНК-связывающими доменами, чем кофакторами или ДНК-дистальными доменами.

Методы

Выявление гиперчувствительных сайтов в 78 типах клеток ENCODE

Мы включили наборы данных о гиперчувствительности к ДНКазе I, полученные в Вашингтонском университете в рамках проекта ENCODE. (Отслеживание в браузере генома wgEncodeUwDnase).Из 161 первоначально рассматриваемого набора данных охватывались 85 различных типов ячеек. Мы исключили некоторые наборы данных с нетипичными спектрами GC-содержимого, уменьшая количество наборов данных до 148 и количество отдельных ячеек типов до 78 (данные не показаны). Мы полагались на выравнивания чтения hg19, перечисленные в дополнительной таблице 2. Для выявления гиперчувствительности областей, мы использовали алгоритм вызова пика F-Seq (Boyle et al. 2008), обрабатывая каждую реплику отдельно.

Мы исключили гиперчувствительные области, пик которых лежал в повторяющейся области (объединение RepeatMasker и Tandem Repeat Finder) и жестко замаскированные повторяющиеся пары оснований в оставшихся сверхчувствительных областях. Мы также жестко маскируем код регионы. Чтобы сделать наборы данных, полученные от разных типов клеток, сопоставимыми, мы ограничили наш анализ до 50 000 самых высокочувствительных клеток. сайты в каждом типе ячеек.Мы также зафиксировали размер каждой сверхчувствительной области на уровне 400 п.н. с центром на пике F-Seq. Гиперчувствительность звонки от реплик были объединены, как описано в следующем подразделе.

Кластеризация типов ячеек в 41 кластер по типу ячеек

Чтобы учесть внутреннее сходство многих рассмотренных типов клеток, мы использовали систематический метод их кластеризации. в когерентные кластеры клеточного типа на основе сходства их профилей гиперчувствительности.Мы представили профили 148 наборов данных как бинарные векторы для всего генома, со значением 1 в положениях внутри сверхчувствительных областей и значением 0 в другом месте. Затем мы вычислили несходство между любыми двумя наборами данных как расстояние Хэмминга между соответствующими двоичными векторами, масштабируется таким образом, чтобы максимальное различие во всех сравнениях равнялось 1.

Мы использовали иерархическую кластеризацию с полной связью, чтобы свернуть 148 наборов данных из 78 типов ячеек в кластеры типов ячеек.Перед кластеризацией мы сначала объединили реплики из того же типа клеток на самом нижнем уровне дендрограммы. Результирующий дендрограмма вместе с порогом, определяющим кластер 41 типа клеток, представлена ​​на дополнительном рисунке 1. Затем мы объединили наборы гиперчувствительных областей, полученные, как описано в предыдущем подразделе, в каждом кластере типов ячеек, объединяющие перекрывающиеся области в единый гиперчувствительный сайт.

Кластер-специфичные гиперчувствительные области были определены как гиперчувствительные области генома в данном кластере клеточного типа, но не в любом другом кластере. В случае частичного перекрытия неперекрывающийся фрагмент считался специфичным для кластера. Для краткости, мы будем называть специфичные для кластера гиперчувствительные области «гиперчувствительными областями, специфичными для определенного типа клеток».

Расчет статистики встречаемости мотива

Все 964 мотива позвоночных из TRANSFAC Professional 2011.2 были использованы в качестве моделей специфичности связывания ТФ. Учитывая пару мотивов, их комплекс мотивов был определен как пара мотивов с заданной взаимной ориентацией и смещением. Смещение было определено как координата крайнего левого положения одного мотива в системе координат другого мотива (с отсчетом от нуля start), тогда как интервал был определен как количество промежуточных нуклеотидов между краями двух мотивов.Допускались перекрывающиеся комплексы мотивов, которые характеризовались отрицательным интервалом. Мы рассматривали только комплексы мотивов с интервалом до 50 п.н. два мотива. Обозначим фиксированную ориентацию и смещение мотивов s и назовем это структурой комплекса мотивов.

Для каждой комбинации типа клетки, пары мотивов ( M ₁ , M ₂ ) и ее структуры s , мы рассчитали значимость перепредставления комплекса мотивов следующим образом.Во-первых, были найдены совпадения с отдельными мотивами. идентифицированы в гиперчувствительных сайтах при пороге оценки мотива, обеспечивающем чувствительность не менее 80% (Rahmann et al. 2003). Пары совпадений мотивов, которые соответствуют указанной структуре s , были взяты в качестве экземпляров комплекса мотивов.

Пусть C ₁₂ (s) и c ₁₂ (s) будет числом наблюдаемых вхождений комплекса мотивов в данном наборе специфичных для клеточного типа гиперчувствительных областей (передний план) и в фоновом наборе всех сверхчувствительных областей соответственно.Кроме того, пусть N ₁₂ (s) и n ₁₂ (s) будет числом всех возможных сложных вхождений на переднем и заднем плане, соответственно. Возможное происшествие Под комплексом мотивов мы подразумеваем любое явление, при котором весь комплекс умещается в соответствующей сверхчувствительной области. Тогда f ₁₂ (с) = C ₁₂ (с) / N ₁₂ (с) – вероятность наблюдения комплекса мотивов с на переднем плане, а b ₁₂ (с) = c ₁₂ (s) / n ₁₂ (s) – вероятность наблюдения комплекса мотивов s на заднем плане.

Пусть C ₁₂ будет общим числом наблюдаемых вхождений на переднем плане пары мотивов (M ₁ , M ₂ ) со структурой s с интервалом до 50 п.н. ориентации. Аналогичным образом мы определяем числа c ₁₂ , N ₁₂ и n ₁₂ . Тогда f ₁₂ = C ₁₂ / N ₁₂ – это вероятность наблюдения на переднем плане пары мотивов ( M ₁ , M ₂ ) в разумном диапазоне структур.Аналогично, b ₁₂ = c ₁₂ / n ₁₂ – это вероятность наблюдения на заднем плане пары мотивов (M ₁ , M ₂ ) в пределах разумного диапазона структур.

Нулевая гипотеза состоит в том, что условная вероятность переднего плана f ₁₂ (s) / f ₁₂ и условная вероятность фона b ₁₂ (s) / b ₁₂ одинаковы.Следовательно, значение P для наблюдения на переднем плане не менее C ₁₂ (с) появлений комплекса мотивов с заданной структурой с может быть рассчитано как вероятность наблюдения не менее C ₁₂ (s) успехов в N ₁₂ (s) испытаний процесса Бернулли с вероятностью успеха f ₁₂ · (b ₁₂ (s) / b ₁₂ ) .

Интуиция за вероятностью успеха схемы Бернулли состоит в том, что это фоновая вероятность b ₁₂ (с) наблюдения данного комплекса мотивов со структурой с с поправкой на коэффициент f ₁₂ / b ₁₂ , , который отражает относительную плотность пар мотивов на переднем и заднем плане.Обратите внимание, что если мы исправим пару мотивов и структуры s , то условная вероятность фона остается неизменной, и выбор типа ячейки (передний план) влияет на вероятность успеха в схеме Бернулли в раз f ₁₂ .

Ограничение набора предсказаний кооперативности

Мы ожидали, что факторы транскрипции, которые связываются кооперативно в конкретном типе клеток, также должны быть предметом индивидуальных чрезмерная представленность в этом типе ячеек.Чтобы учесть это ожидание, мы рассматривали только пары мотивов, удовлетворяющие условию f ₁₂ ≥ b ₁₂ , т. Е. Пары мотивов, которые как минимум так же часто встречаются на переднем плане, как и на заднем (в разумных пределах конструкций).

Другое ограничение напрямую соответствовало стерическим препятствиям между двумя TF. Некоторые подходы, например, Whitington et al.(2011), требуют, чтобы мотивы, образующие комплекс мотивов, не перекрывались. Однако многие из доступных мотивов содержат избыточные малоинформативные позиции на концах, что помешало бы предсказанию подлинного сотрудничества ФТ. Следовательно, предыдущие исследования могли не избежать обрезки малоинформативных фланговых областей мотивов. Мы решили применить другой подход, позволив несовершеннолетним мотив перекрывается, чтобы сохранить всю информацию, содержащуюся в моделях сродства связывания.Наша статистика учитывает возможные чрезмерное или недостаточное представительство комплексов мотивов, состоящих из перекрывающихся мотивов (Рис. 1B). Как объясняется ниже, чрезмерное наложение мотивов было запрещено как маловероятное; комплексы мотивов с преобладанием одного отдельных мотивов также были запрещены.

Для измерения степени перекрытия мы ввели понятие перекрывающегося информационного содержания .Для каждой позиции перекрывающегося мотива мы определяем его как минимум из двух значений информационного содержания перекрывающегося мотивы. Для всего комплекса мотивов мы определили его как сумму перекрывающихся значений информационного содержания, варьирующихся от все перекрывающиеся позиции. Мы назвали перекрытие второстепенным , если перекрывающееся информационное содержание не превышало 2 бита. Мы запретили основных (то есть не второстепенных) перекрытий, потому что такие конфликтующие конфигурации вряд ли соответствуют прямой кооперативности TF.

Мы также исключили комплексы мотивов, в которых один из отдельных мотивов доминирует над всем комплексом. Чтобы измерить долю индивидуального мотива в комплексе мотивов, мы определили информационного вклада каждого мотива. Для позиции неперекрывающегося мотива она просто равна информационному содержанию отдельного мотива. на этой позиции. Для перекрывающейся позиции мотива, если два мотива различаются по информационному содержанию в этой позиции, тогда информационный вклад в этой позиции более информативного мотива равен его информационному содержанию в этой позиции, а информационный вклад в этой позиции другого мотива устанавливается равным 0.В случае равного информационного содержания, оба мотива имеют информационный вклад в этой позиции, равный половине их информационного содержания в этой позиции. Информационный вклад мотива в мотивный комплекс мы определили как сумму значений его информационного вклада, ранжирование по всем позициям. Мы рассматривали только те комплексы мотивов, в которых оба отдельных мотива содержали информацию вклад не менее 6 бит.

Чтобы избежать артефактов, возникающих из-за отдельных мотивов, которые крайне редко встречаются в гиперчувствительных сайтах, мы рассмотрели только комплексы мотивов, которые встречаются по крайней мере 100 раз в областях гиперчувствительности, специфичных для конкретного типа клеток ( C ₁₂ (s) ≥ 100). Более того, мы знали, что определенные мотивы похожи сами на себя в другой раскладке. В частности, чрезмерное представительство определенного комплекса мотивов вызывает возможное чрезмерное представительство комплексов теневых мотивов, состоящих из тех же мотивов, но с измененным смещением или ориентацией.Поэтому мы разрешили только одно появление каждой комбинации пары мотивов и клетки. тип, включающий только комплекс мотивов с наименьшим значением P . Наконец, мы рассмотрели только чрезмерно представленные комплексы мотивов с исправленным значением P <0,05. Значения P были скорректированы по Бонферрони путем умножения на общее количество проверенных гипотез по всем парам мотивов, ориентации, смещения и типы ячеек (∼1.4 миллиарда).

Кластеризация прогнозов кооперативности

Из-за избыточности используемой базы данных мотивов единичное кооперативное взаимодействие TF – TF может быть указано как множественное, взаимно повторяющиеся комплексы мотивов (см., например, дополнительный рис. 3). Поэтому мы сгруппировали 5233 чрезмерно представленных комплекса мотивов. как описано ниже.Для каждого комплекса мотивов мы вычислили его представителя, названного мотивом димера , путем подсчета частот нуклеотидов во всех его экземплярах, включая запас в 5 п.н. с обеих сторон.

По предположению Гупты и др. (2007) мы использовали квадрат евклидова расстояния (ED ² ) в качестве меры различия димерных мотивов, предполагая, что порог кластеризации равен 2 для ED ² . Перепредставленные комплексы мотивов были ранжированы по значению P в порядке возрастания.Мы жадно сгруппировали их, впоследствии сравнивая каждый комплекс с уже установленными. кластеры. Сравнение проводилось путем расчета ED ² между рассматриваемым комплексом и наиболее значимым комплексом мотивов в рассматриваемом кластере. Если какой-либо ED ² был меньше 2, то рассматриваемый комплекс объединяли с его аналогом с наименьшим значением P и исключали из дальнейших сравнений; в другом случае был создан новый кластер.Таким образом мы получили 603 кластера, которые мы называем предсказанными димерами или просто предсказаниями . Каждому прогнозу было присвоено значение P его наиболее значимого комплекса мотивов, который мы называем комплексом мотивов сигнатуры . Следовательно, каждое предсказание характеризовалось типами клеток, в которых был предсказан его комплекс сигнатурных мотивов.

В редких случаях может случиться так, что более длинный мотив мономера может быть сконструирован путем объединения двух коротких вырожденных мотивов.К Чтобы облегчить идентификацию таких артефактов вручную, мы сообщили о случаях, когда мотив димера близко соответствовал (ED ² <2) единственному мотиву из базы данных (см. дополнительную таблицу 4). Обратите внимание, что было бы нецелесообразно автоматически отбросьте такие димерные мотивы из-за загрязнения баз данных мотивов димерными мотивами (например, SOX-OCT).

Группирование и обрезка отдельных мотивов

Все отдельные 964 мотива были сгруппированы таким образом, чтобы получить ТФ-ориентированное представление наших прогнозов.Мы использовали полную привязку иерархическая кластеризация на основе ED ² между мотивами для получения 350 кластеров мотивов. Порог кластеризации был установлен на 2, то есть все мотивы в одном мотиве кластер имел парные ЭД ² не более 2.

Обрезка мотивов на дополнительном рисунке 4 была реализована, как в Whitington et al. (2011), удалив неинформативные пары оснований с флангов.Другими словами, мы удалили все столбцы с информационным содержанием. ≤0,25 бита с обеих сторон отдельного мотива.

Сравнение с атласом комбинаторной регуляции транскрипции

Атлас содержит взаимодействия между человеческими ТФ, полученными в результате двухгибридных анализов на млекопитающих и дополненных низкой пропускной способностью. экспериментальные данные в литературе (дополнительная таблица S2 в Ravasi et al.2010). Взаимодействия хранятся в виде 5238 пар идентификаторов (ID) Entrez. Для сравнения мы сопоставили TRANSFAC идентификаторы мотивов из наших предсказанных комплексов на идентификаторы Entrez с использованием сопоставления по умолчанию, предоставленного TRANSFAC. Как результат, 836 мотивов TRANSFAC были сопоставлены с 523 идентификаторами Entrez методом «многие ко многим».

Чтобы оценить соответствие наших прогнозов атласу, мы использовали гипергеометрический тест.Мы устанавливаем пространство пар равным образуют совокупность всех 136 503 возможных пар на наборе из 523 отображаемых идентификаторов Entrez ID. Предсказанные пары мотивов TRANSFAC сопоставить с подмножеством 7941 пары в этой вселенной, составляя набор испытаний. Набор успехов – это подмножество 1288 Entrez Пары ID из всех 5238 пар, хранящихся в атласе, в которых каждый компонент может быть сопоставлен с одним из 836 мотивов TRANSFAC. Пересечение с атласом дается набором из 279 успешных испытаний, т.е.е. пары Entrez ID, которые можно отобразить из предсказанные пары и хранятся в атласе.

Чувствительность 21,7% была оценена как отношение количества успешных испытаний (279) к количеству успешных (1288). Это 3,7 раз выше, чем чувствительность 5,8%, ожидаемая исключительно по чистой случайности, учитывая соотношение испытаний (7941) и размер Вселенная (136 503).

Наши прогнозы в виде пар мотивов TRANSFAC были сгруппированы в 603 кластера похожих пар, причем каждый кластер интерпретировался. как одно предсказание комплекса.Существует 563 отображаемых кластера, то есть кластеров, которые содержат хотя бы одну пару мотивов TRANSFAC. причем оба компонента принадлежат набору из 836 картированных мотивов. Атлас подтверждает 91 из этих кластеров. т.е. содержать по крайней мере одну пару мотивов, которая отображается на пару идентификаторов Entrez, хранящихся в атласе. Чтобы оценить точность из наших прогнозов относительно атласа мы вычислили долю отображаемых кластеров, которые подтверждаются атласом (91 из 563), что дает 16.2% точность.

Сравнение с подходом Whitington et al., Основанным на ChIP-seq. (2011)

Мы повторили наш вычислительный эксперимент, используя мотивы, описанные Whitington et al. (2011). В случае, если они использовали нестандартный мотив, мы применили ближайший аналог, найденный в TRANSFAC, обрезанный или расширенный, соответственно. В нашем методе мы скорректировали порог чувствительности мотива от 0.От 8 до 0,95, так что количество вхождений отдельных мотивов в геноме был достаточно большим, чтобы статистика чрезмерного представительства была сильной.

Расчет плотности разреза ДНКазы I

Мы сравнили количество разрезов DNase I между экземплярами предсказанного комплекса мотива сигнатуры и экземплярами его небольшие изменения, которые мы обозначаем как неправильно расположенные комплексы , состоящие из тех же двух мотивов, но с немного увеличенным расстоянием между ними, на +1 до +10 п.н.Оба набора содержали только экземпляры в гиперчувствительных сайтах, специфичных для типов клеток, для которых был сделан прогноз кооперативности. Имея исправлено одно предсказание, мы вычислили паттерны переваривания ДНКазы I как для предсказанных сложных экземпляров, так и неправильно разнесенные сложные экземпляры, как показано на рисунке 3. Наша оценка плотности разрезания ДНКазы I представляла собой количество разрезов ДНКазы I в районе ± 100 п.н. вычисляется с треугольным ядром и нормализуется в каждом прогнозе, так что его среднее значение для неправильно расположенных комплексов равно 1.Затем мы использовали тест Манна-Уитни U , чтобы оценить, являются ли экземпляры предсказанного комплекса мотивов более обогащенными разрезами ДНКазы I, чем неправильно расположенные сложные экземпляры.

Расчет эволюционной оценки сохранения

Мы использовали тот же подход, что и для оценки плотности разрезания ДНКазы I, сравнивая предсказанные и неправильно расположенные комплексы.Для каждого появления комплекса мотивов мы вычислили средневзвешенное значение пар оснований приматов phyloP между видами. оценки ограничений (Pollard et al. 2010), где веса были пропорциональны информационному содержанию в соответствующем нуклеотиде в димерном мотиве. Этот взвешивание оправдано тем фактом, что позиции с более высоким информационным содержанием, вероятно, будут более ограниченными. Опять же, мы использовали Mann-Whitney U -тест, чтобы оценить, являются ли экземпляры предсказанного комплекса мотивов более консервативными, чем экземпляры комплексов с неправильно расположенными интервалами.

Благодарности

Мы благодарим группу Стаматояннопулоса из Вашингтонского университета, а также проект ENCODE и координацию данных ENCODE. Центр в UCSC для предоставления наборов данных о гиперчувствительности к ДНКазе I. Работа поддержана Агентством по науке и технологиям. и исследования (A * STAR Singapore), грант офиса Объединенного совета No.JCOAG03_FG02_2009, Министерство науки и высшего образования (Польша) грант № N N 301 065236 и гранты Национального научного центра (Польша) № N N519 652740 и 2011/03 / N / NZ2 / 03177.

Сноски

• №7 Автор, ответственный за переписку

  Электронная почта tiuryn ​​{at} mimuw.edu.pl

• [Дополнительные материалы доступны к этой статье.]

• Статья перед печатью публикуется в сети. Статья, дополнительные материалы и дата публикации находятся по адресу http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.154922.113.

  В свободном доступе онлайн через опцию открытого доступа Genome Research .

• Поступила 15.01.2013.
• Принята к печати 2 апреля 2013 г.

Компактность денатурированного состояния быстро сворачивающегося белка, измеренная методом субмиллисекундного малоуглового рассеяния рентгеновских лучей

Реферат

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей с временным разрешением использовали для измерения радиуса инерции цитохрома c после инициации сворачивания в результате скачка pH. Субмиллисекундное временное разрешение было получено с помощью диффузионного миксера микроизготовления и синхротронного излучения.Результаты показывают, что белок сначала коллапсирует до уплотнения денатурированных структур, а затем очень быстро сворачивается в нативное состояние.

Стабильность и скорость сворачивания белка зависят от структур денатурированного, а также нативного состояния, в связи с чем возникает вопрос: укладываются ли белки быстрее из денатурированного состояния расширенных структур или из одной из компактных структур? Моделирование на решетке упрощенных представлений белков указывает на то, что последовательности аминокислот с медленным сворачиванием коллапсируют в компактные структуры с ненативной топологией перед сворачиванием, тогда как быстрые папки коллапсируют и сворачиваются одновременно (1-4).Мы начали решать этот вопрос экспериментально с субмиллисекундного малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР) с использованием синхротронного излучения и микроволоконного диффузионного смесителя для быстрого инициирования сворачивания. SAXS дает радиус вращения, наиболее однозначную меру компактности. Здесь мы показываем, что, в отличие от моделирования, один из наиболее быстро сворачивающихся белков (цитохром c : τ _{сворачивание} = 400 мкс) сначала коллапсирует до компактных структур перед формированием окончательного нативного состояния.

Рассеяние рентгеновских лучей белками в растворе чувствительно к пространственным изменениям электронной плотности. Рассеяние под наименьшими углами дает радиус вращения, R _g , который в сочетании с молекулярной массой белка обеспечивает меру компактности глобулярных белков. Дополнительная структурная информация может быть получена путем рассеяния на большие углы, которое отражает корреляции электронной плотности на масштабах короче, чем R _g . Для компактного полимера, такого как нативный белок или компактные денатурированные структуры, I (q) q ² увеличивается при низком q, проходит через максимум и уменьшается при большом q, где I (q) αq ⁻⁴ [I (q) – интенсивность рассеяния; q = 4πsin θ / λ, – переданный импульс; λ – длина волны рентгеновского излучения, 1.54 Å; 2θ – угол рассеяния] (5). Напротив, для полимерной цепи, совершающей случайное блуждание в пространстве, как это может происходить для развернутого белка в сильно денатурирующих условиях, сначала увеличивается I (q) q ² , затем – плато (6) и, при больших q, где I (q) αq ⁻¹ , линейно возрастает (7). Таким образом, используя графики Кратки [I (q) q ² vs. q], можно легко отличить случайную катушку от компактных конформаций, что делает SAXS с временным разрешением мощным инструментом для исследования структуры в экспериментах по сворачиванию белков (8–8). 10).

Из-за более простого кинетического поведения небольшие однодоменные белки были в центре внимания как экспериментальных, так и теоретических исследований механизма сворачивания белков. Время сворачивания этих белков в отсутствие денатуранта часто меньше ≈10 мс (11), что слишком быстро для изучения с помощью технологий смешивания, использованных в предыдущих исследованиях SAXS с временным разрешением (8-10). Мы увеличили временное разрешение почти на 2 порядка за счет использования миксера, изготовленного методом литографии.Его конструкция основана на том принципе, что времена диффузионного смешивания масштабируются как квадрат линейного размера смешиваемого объема. Короткое время перемешивания достигается за счет гидродинамической фокусировки, которая создает микронный или субмикронный поток белкового раствора в контакте с окружающим проточным резервуаром (12). Мы изготовили устройство, совместимое с рентгеновскими лучами, на заводе по производству нанофабрикатов в Корнелле (рис. 1). Для этих экспериментов было необходимо синхротронное излучение из-за сочетания объемов микропрепаратов и обычно слабого рассеяния белковых растворов.Рассеяние с временным разрешением получали путем пропускания микроколлимированного рентгеновского луча через образец в фиксированных местах в текущем потоке раствора белка. Относительное время определяли по скорости потока белка и положению рентгеновского луча.

Схема диффузионного смесителя.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На рис. 1 показано поперечное сечение центральной части диффузионного смесителя. Каналы имеют ширину 100 мкм и глубину 390 мкм.Во время работы 2,5 мМ цитохрома c в HCl при pH 2 вводят во входной порт (рис. 1 слева ). Мы выбрали цитохром c (104 а.о., номер в каталоге Sigma C7752) для нашего первоначального исследования с использованием этого метода, потому что его кинетика сворачивания до времен 50 мкс уже была охарактеризована (13–18). 0,1 М фосфатный буфер при pH 7, содержащий 0,2 М имидазола, вводимый в ортогональные каналы при более высоком давлении, гидродинамически фокусирует раствор с низким pH, содержащий белок, в тонкую струйку (12).Этот сфокусированный поток белка, защищенный буфером с pH 7, выстреливает из четвертого выходного порта устройства (рис. 1 , правый ). Быстрое увеличение pH происходит за счет диффузии протонов из сфокусированного белкового раствора и буфера в нем. Хотя поток в конечном итоге достигает pH 7, исследования равновесия показывают, что цитохром c почти полностью нативен при pH выше 3 (19). Как только pH концентрированного белкового раствора становится выше 3, белок сворачивается по мере того, как он течет. Данные о рассеянии в разное время можно получить, перемещая устройство относительно фиксированного положения рентгеновского луча.

Рентгеновские эксперименты проводились на D-линии Корнельского высокоэнергетического синхротронного источника с использованием многослойного монохроматора для усиления луча изгибающего магнита. Луч в образце имел поток 10 ⁹ рентгеновских лучей / с в область, которая составляла 40 мкм по ширине потока белка и 120 мкм по направлению потока. Детектор области устройства с зарядовой связью (20) использовался для регистрации картин рассеяния.

В результате больших размеров этих каналов задействованы низкие управляющие давления для жидкостей, а ширина и скорость сфокусированного белкового раствора значительно варьируются в зависимости от глубины в канале.На поверхности устройства поток белка имел ширину около 40 мкм; его ширина быстро уменьшалась с глубиной, и был большой участок шириной 2,5 мкм. PH этого тонкого среза поднялся выше 3 в течение примерно 200 мкс, как определено конфокальной микроскопией с pH-чувствительным флуоресцентным красителем (соответствующее положение в приборе определено как t = 0 для анализа). Этот метод обеспечивает прямое измерение диффузии протонов. Белковый поток также расширяется в результате диффузии; однако из-за большей массы макромолекул они диффундируют намного медленнее, чем протоны.Ожидается, что на выходе из выходного канала средняя конечная концентрация белка будет в два раза меньше начальной концентрации. Средняя скорость сфокусированного белкового раствора для работы, описанной в этой статье, составляла 30 см / с.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Графики Кратки данных с трех позиций в устройстве показаны на рис. 2. Для начального состояния, измеренного в позиции до смешивания, произведение Iq ² увеличивается почти линейно при большом q, что указывает на то, что средняя структура равна расширенная и случайная катушка.Однако невозможно извлечь R _g из данных при низком q из-за помех, вызванных высокой концентрацией сильно заряженного белка (21) (2,5 мМ соответствует среднему разделению ≈10 нм; в высокая концентрация химического денатуранта при pH 7, но при низкой концентрации белка и, следовательно, при небольшом влиянии межчастичного рассеяния, R _g составляет 30–32 Å, а график Кратки указывает на рассеяние, подобное случайной катушке; ссылка 22). Во второй позиции, примерно обозначенной на рис.1 и соответствует интервалу времени от 150 до 500 мкс после смешивания, уменьшение Iq ² при больших q характерно для компактной структуры. Подгонка данных при низком q к функции K q ² exp (-R _g ² q ² /3) (K – инструментальная постоянная) дает кажущееся значение R _g , равное 15,9 ± 0,7 Å. . График Кратки для положения, соответствующего среднему времени 10 мс после смешивания, идентичен графику для нативного белка в равновесии и дает R _g = 13.9 ± 0,4 Å, то же значение, измеренное в предыдущих экспериментах по МУРР в равновесии (22, 23). Данные соответствовали q <0,15, диапазону, который отлично подходит для более качественных статических данных.

Сюжеты Кратки с временным разрешением. ( a ) График Кратки белка во впускном канале, слева от креста на рис. 1, показывает, что исходное (pH 2) состояние расширено и имеет случайную спиралевидную форму. (b ) Паттерн SAXS после того, как устройство было переведено для освещения потока белка, как показано на рис.1, 200 мкм от центра креста. Это рентгеновское облучение усреднялось за интервал времени от 150 до 500 мкс, предполагая, что поток белка перемещался со своей средней скоростью по массе. Примерно 90% объема раствора белка было выше pH 3 в этом интервале. Мы вычли 10% от начального состояния pH 2 из наблюдаемого графика Кратки в этой позиции, чтобы построить кривую, показанную в b . Простой расчет, основанный на этих средних числах и с использованием констант скорости для скачка pH до 4.5 (15, 18) указывает, что 45% белка с pH выше 3 в этом месте находились в денатурированном состоянии, а 55% – в нативном состоянии. Измеренный R _g из данных b (R _g ^app = 15,9 ± 0,7 Å) относится к денатурированному (R _g ^D ) и нативному (R _g ^N ) гласит следующее: (R _g ^{приложение} ) ² = f _D (R _g ^D ) ² + f _N (R _g ^N ) ² , где f _{D / N} представляет собой долю образца в денатурированном / нативном состоянии (22).Наш расчет f _D является нижним пределом (следовательно, наш расчетный R _g ^D = 18,1 ± 0,9 Å является верхним пределом) по следующим причинам: ( i ) Мы проигнорировали вклад от расширенного денатурированное состояние при расчете R _g компактного денатурированного состояния из R _g ^{приложение} . ( II ) Мы ожидаем, что сворачивание будет происходить медленнее при конечном pH 3, чем при расчетном конечном pH 4,5. ( iii ) Имидазол может не связываться полностью, прежде чем неместные гистидины образуют неправильно свернутые структуры, которые укладываются медленнее, чем комплекс имидазола (13-15).( iv ) Расчет предполагает, что весь белок смешан при t = 0, положении, в котором смешивается самый тонкий участок 2,5 мкм. Смешивание на самом деле является непрерывным процессом, при этом более толстые части смешиваются позже. ( c ) График Кратки в положении, которое соответствует времени ≈10 мсек после смешивания (красная, зашумленная кривая). Эти данные предполагают, что белок полностью свернулся до нативного состояния. График Кратки для гораздо большего образца природного цитохрома c в равновесии при pH 7 показан в виде зеленой (гладкой) кривой, нанесенной поверх данных.Наилучшее соответствие данным в b и c показано пунктирными синими линиями.

Результатом наших экспериментов является диаграмма рассеяния рентгеновских лучей на промежуточном временном интервале 150–500 мкс. Однако в этот период наблюдается вклад в наблюдаемое рассеяние от структур более чем одного состояния белка. Предыдущие субмиллисекундные кинетические исследования флуоресценции могут быть использованы для определения относительных вкладов (15, 18). В этих исследованиях за сворачиванием следили по затуханию флуоресценции триптофана, которое является результатом повышенного тушения гемом за счет передачи энергии возбуждения Форстера по мере уменьшения расстояния между гемом и триптофаном.В условиях нашего эксперимента затухание флуоресценции двухфазное: ≈80% амплитуды затухает при релаксации 50 мкс (18) и ≈20% при последующем формировании нативной структуры, происходящем при релаксации 400 мкс (15 , 18). На основе анализа амплитуд и скоростей релаксации с тремя состояниями был сделан вывод, что равновесная смесь двух денатурированных состояний существует в конце 50-мкс релаксации, что соответствует компактным и расширенным денатурированным структурам в соотношении примерно 5: 1 ( 18).Компактность была принята из-за низкого квантового выхода флуоресценции, оцененного как <5%, что соответствует среднему расстоянию гем-триптофан <2,0 нм (по сравнению с ≈1 нм в нативной структуре и ≈4 нм в структурах, денатурированных кислотой). . Таким образом, согласно этой модели, наш наблюдаемый график Кратки в промежуточном временном диапазоне, при 150–500 мкс, в основном представляет собой линейную комбинацию графиков Кратки из двух состояний: компактного денатурированного и нативного. Из-за неполного перемешивания также есть небольшой вклад денатурированного белка при pH 2.Используя населенности из кинетики флуоресценции, мы рассчитали верхний предел компактного денатурированного состояния для R _g , 18,1 ± 0,9 Å. Таким образом, R _g компактных денатурированных структур не более чем на 30% больше, чем у исходной структуры. Такое же соотношение наблюдается для денатурированного состояния, образованного добавлением соли при pH 2, которая разрушает структуру из-за экранирования противоиона электростатического отталкивания между 24 положительно заряженными остатками (23).Таким образом, в отсутствие денатуранта один из известных белков с наиболее быстрой сворачиванием сначала коллапсирует, образуя относительно компактное денатурированное состояние.

Интересно сравнить этот результат с симуляциями на решетке (1–4) упрощенных представлений белков, которые предполагают, что белки складываются быстрее, если они сначала не коллапсируют с образованием компактных структур. В моделировании эти разрушенные денатурированные структуры неправильно свернуты. Последующий шаг по формированию собственной топологии замедляется, потому что он включает в себя разрыв многих неродных контактов.Если, с другой стороны, сворачивание и схлопывание происходят одновременно, образуется меньше неродных контактов, и сворачивание при моделировании происходит быстрее. Интересное объяснение очевидного расхождения между нашим экспериментальным результатом и моделированием предлагается выражением скорости сворачивания, рассматриваемого как диффузия полипептида на частично шероховатом ландшафте свободной энергии (24, 25). В этом описании время сворачивания τ _f определяется выражением (24): 1, где ΔQ ² – это среднеквадратичная флуктуация конфигурационной координаты в денатурированном состоянии, ΔE ² – шероховатость энергетического ландшафта. , D _o – константа диффузии в отсутствие шероховатостей, а ΔF ^‡ – барьер свободной энергии, разделяющий денатурированное и собственное состояния.Если компактное денатурированное состояние имеет родную, а не неправильно свернутую топологию, уравнение. 1 предсказывает, что сворачивание происходит быстрее, поскольку ожидается, что все три члена в этом выражении для τ _f будут меньше. Эти соображения предполагают, что одним из вкладов в быстрое сворачивание цитохрома c является нативная топология денатурированного состояния (30). Существуют экспериментальные доказательства, подтверждающие эту гипотезу, из экспериментов по обмену амида, которые показывают, что компактное денатурированное состояние содержит сегменты собственной спиральной структуры (26).Конечно, было бы очень важно, если бы топология, подобная нативной, была общим свойством компактных денатурированных состояний (27). Тогда «проблема сворачивания» на уровне общей топологии будет решена для этого класса белков в начальном быстром коллапсе полипептидной цепи (τ _{коллапс} = 50 мкс для цитохрома c ; ссылка 18). Более того, быстрый коллапс до нативных топологий с захоронением гидрофобных остатков может иметь биологическое преимущество за счет уменьшения агрегации и протеолиза (28).

Текущая работа предполагает, что будет важно получить систематические данные о кинетике сворачивания и SAXS с временным разрешением для ряда белков. Таким исследованиям в значительной степени помогут великолепные синхротронные источники третьего поколения, которые имеют микрофокусированные пучки микронных размеров, в 100 раз более интенсивные, чем используемые здесь. Вместе с более быстрыми потоками и более тонкими потоками временное разрешение станет возможным на порядок быстрее. Получение более высоких данных о рассеянии сигнал-шум также должно позволить определить дополнительную структурную информацию о компактном денатурированном состоянии (29).

Благодарности

Мы благодарим Э. Фонтеса, М. Новака, М. Скварла, П. Инфанте, В. Ципфеля и Р. Уильямса за ценную помощь, а также Дж. Хофрихтера, В. Муньоса, А. Сабо, С. Дж. Хагена, Дж. Тревеллу. и Д. Шеллоуэй за полезные обсуждения. В этой работе использовался синхротронный источник высокой энергии Корнелла, национальный пользовательский объект, поддерживаемый Национальным научным фондом; Корнельский завод нанофабрикций, поддерживаемый Национальным научным фондом, Корнельским университетом и промышленными филиалами; и «Ресурсы для разработки биофизических изображений и оптоэлектроники» в Корнелле, Национальном институте здравоохранения и Национальном центре исследовательских ресурсов.Работа поддержана грантами Национального научного фонда и Министерства энергетики США.

СОКРАЩЕНИЕ

SAXS,

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

• Добавить комментарий Отменить ответ

  Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

  Комментарий *

  Имя *

  Email *

  Сайт