Искусственно состаренный: ИСКУССТВЕННО СОСТАРЕННЫЙ КОВЕР – КОВРЫ – ГОСТИНАЯ

Содержание

Искусственно состаренный интерьер: модно, стильно

62 Просмотра ,

Удивительно странен мир: одни избавляются от старой мебели, а другие специально делают ее таковой. В последние годы все чаще в портфолио известных дизайнеров можно увидеть необычную мебель, странную отделку. Они выглядят как старые, но при этом имеют вполне современную форму. Оказывается, подобная мебель и оформление интерьера очень популярны при внедрении стиля «шебби-шик».

Что такое «шебби-шик»

Этот стиль появился относительно недавно, в 1980-х годах, благодаря девушке по имени Рэйчел Эшвил. Она определила его как «винтаж с вкраплениями пастельных цветов и кружев в виде декоративных элементов». Если же говорить о переводе названия с английского, то получим «поношенный, потертый» шик.

Сделать интерьер в стиле шебби-шик, с одной стороны, достаточно просто. Но с другой – потребуется изысканный вкус и чувство меры. Можно добавить всего три элемента, чтобы получить соответствующий эффект – комод, паркет и патину. Но важно, чтобы все это напоминало винтаж. То есть должны быть потертости, даже трещины.

Интересно, что в таком интерьере также важен и декор в виде ангелочков и розочек. Именно они делают стиль нежным, женственным и очень романтичным.

Как состарить мебель, не потратив миллионы

Не все могут позволить себе благородный версальский паркет или винтажную мебель. Но это и необязательно. Многие декораторы и дизайнеры интерьеров предпочитают работать с современными предметами, используя определенные приемы.

Оформляем пол. Как ранее уже было сказано, не обязательно приобретать дорогой версальский паркет, подойдет напольное покрытие и отечественного производителя. А сделать его несколько устаревшим помогут укладка по рисунку старых наборных щитов, царапины, потертости. Кстати, их можно организовать самостоятельно – во время покрытия паркета лаком можно специально делать это небрежно.

Занимаемся стенами. Вот уж где раздолье для вашей фантазии! Начнем с самого простого варианта – покрасим стены водостойкой краской. Это будет основа. Затем берем губку и наносим более темный тон на поверхность, создавая эффект потертости. Эту процедуру можно повторить несколько раз возле светильников и выключателей, то есть наиболее часто используемых зон.

Искусственно состаренные вещи

Искусственно состаренная одежда или обувь снова в моде, впрочем, она никуда и не уходила, она в моде уже довольно длительное время. Такие вещи можно отнести с лёгкостью и к стилю неовинтаж, если выполнены они по модным моделям прошлых годов, либо к стилю гранж, если современная одежда является просто состаренной, ведь для стиля гранж в целом и характерна некоторая небрежность и потёртость в вещах. Получается, что старая куртка не просто старая, но также ещё и модная.

Вещи со временем, как бы ни старательно и аккуратно они использовались при ношении, всё равно рано или поздно потеряют свой первоначальный презентабельный вид. Одежда теряет свой цвет, блекнет, вытягивается, джинсы протираются и даже рвутся, обувь приобретает потёртости и царапины. Аксессуаров это тоже касается. Ремни, даже кожаные, за пару лет при ежедневном использовании вытягиваются и приобретают особый оттенок, кожа блекнет. Вещи изнашиваются со временем, а можно купить новые искусственно состаренные.

Неовинтаж, гранж или кэжуал?

Да, и не стоит путать вид старины (который больше соответствует стилю неовинтаж) и изношенности (который можно отнести к стилю гранж). Гранж в целом можно отнести к самым простым стилям и если кофта или футболка уже, как говорится, «долго пожила и видела многое», то её ещё можно носить и носить, она как раз соответствует данному направлению в моде. Потёртые и порванные джинсы в моде уже довольно давно. Конечно же, всё в разумных пределах и если одежда или обувь уже изжила своё, лучше всё-таки купить новую, можно и состаренную, если нравится такой стиль в одежде. Некоторая потёртость и состаренность одежды или обуви может также сочетаться с повседневным стилем кэжуал.

Искусственно состаренная и поношенная одежда

Между искусственно состаренной и поношенной одеждой есть отличие. В первую очередь это касается структуры тканей и свойств изделия. Например,поношенная куртка может потерять свою первоначальную форму и вытянуться в то время, как искусственно состаренная будет иметь презентабельный внешний вид. Изношенная обувь может приобрести трещины и даже дыры в подошве, что будет непригодно для ношения, так как обувь потеряет свои свойства (защиту от грязи и сохранение тепла). Искусственно состаренная обувь будет прекрасно справляться со всеми возложенными на неё функциями и свойствами и будет иметь только характерный внешний вид старины.

Самой популярной и актуальной является именно кожаная состаренная одежда и обувь, а также аксессуары из кожи (например, сумки и рюкзаки, ремни, шляпы). Кожаные куртки прекрасно смотрятся как новые, так и состаренные. Кожа является долговечным и износостойким материалом и вполне возможно, что любимая старая кожаная куртка может оказаться модной вещью в вашем гардеробе. Кстати, то же самое можно сказать и про джинсовые вещи.

Искусственно состаренные двери

1,9 м * 0,8 м (=6800.00Р)

1,9 м * 0,7 м (=6800.00Р)

1,8 м * 0,8 м (=6800.00Р)

1,8 м * 0,7 м (=6800.00Р)

1,7 м * 0,8 м (=6800.00Р)

1,7 м * 0,7 м (=6800.00Р)

1,6 м * 0,8 м (=6800.00Р)

1,6 м * 0,7 м (=6800.00Р)

Красивые кухни с искусственно-состаренными фасадами – 135 лучших фото дизайна интерьера кухни

Curtis and Peggy had been thinking of a kitchen remodel for quite some time, but they knew their house would have a unique set of challenges. Their older Victorian house was built in 1891. The kitchen cabinetry was original, and they wanted to keep the authenticity of their period home while adding modern comforts that would improve their quality of life. A friend recommended Advance Design Studio for their exceptional experience and quality of work. After meeting with designer Michelle Lecinski at Advance Design, they were confident they could partner with Advance to accomplish the unique kitchen renovation they’d been talking about for years. “We wanted to do the kitchen for a long, long time,” Curtis said. “(We asked ourselves) what are we actually going to do? How are we going to do this? And who are we going to find to do exactly what we want?” The goal for the project was to keep the home renovation and new kitchen feeling authentic to the time in which it was built. They desperately wanted the modern comforts that come with a larger refrigerator and the dishwasher that they never had! The old home was also a bit drafty so adding a fireplace, wall insulation and new windows became a priority. They very much wanted to create a comfortable hearth room adjacent to the kitchen, complete with old world brick. The original cabinetry had to go to make way for beautiful new kitchen cabinetry that appears as if it was a hundred years old, but with all the benefits of cutting-edge storage, self-closing drawers, and a brand-new look. “We just wanted to keep it old looking, but with some modern updates,” Peggy said. Dura Supreme Highland Cabinets with a Heritage Old World Painted Finish replaced the original 1891 cabinets. The hand-applied careful rubbed-off detailing makes these exquisite cabinets look as if they came from a far-gone era. Despite the small size of the kitchen, Peggy, Curtis and Michelle utilized every inch with custom cabinet sizes to increase storage capacity. The custom cabinets allowed for the addition of a 24” Fisher Paykel dishwasher with a concealing Dura Supreme door panel. Michelle was also able to work into the new design a larger 30” Fisher Paykel French refrigerator. “We made every ¼ inch count in this small space,” designer Michelle said. “Having the ability to custom size the cabinetry was the only way to achieve this.” “The kitchen essentially was designed around the Heartland Vintage range and oven,” says Michelle. A classic appliance that combines nostalgic beauty and craftsmanship for modern cooking, with nickel plated trim and elegantly shaped handles and legs; the not to miss range is a striking focal point of the entire room and an engaging conversation piece. Granite countertops in Kodiak Satin with subtle veining kept with the old-world style. The delicate porcelain La Vie Crackle Sonoma tile kitchen backsplash compliments the home’s style perfectly. A handcrafted passthrough designed to show off Peggy’s fine china was custom built by project carpenters Justin Davis and Jeff Dallain to physically and visually open the space. Additional storage was created in the custom panty room with Latte Edinburg cabinets, hand-made weathered wood shelving with authentic black iron brackets, and an intricate tin copper ceiling. Peggy and Curtis loved the idea of adding a Vermont stove to make the hearth-room not only functional, but a truly beckoning place to be. A stunning Bordeaux red Vermont Castings Stove with crisp black ventilation was chosen and combined with the authentic reclaimed Chicago brick wall. Advance’s talented carpenters custom-built elegant weathered shelves to house family memorabilia, installed carefully chosen barn sconces, and made the hearth room an inviting place to relax with a cup of coffee and a good book. “Peggy and Curtis’ project was so much fun to work on. Creating a space that looks and feels like it always belonged in this beautiful old Victorian home is a designer’s dream. To see the delight in their faces when they saw the design details coming together truly made it worth the time and effort that went into making the very compact kitchen space work”, said Michelle. “The result is an amazing custom kitchen, packed with functionality in every inch, nook and cranny!” exclaims Michelle. The renovation didn’t end with the kitchen. New Pella windows were added to help lessen the drafts. The removal of the original windows and trim necessitated the re-creation of hand-made corbels and trim details no longer available today. The talented carpenter team came to the rescue, crafting new pieces and masterfully finishing them as if they were always there. New custom gutters were formed and installed with a front entry rework necessary to accommodate the changes. The whole house functions better, but it still feels like the original 1891 home. “From start to finish it’s just a much better space than we used to have,” Peggy said. “Jeff and Justin were amazing.” Curtis added; “We were lucky to find Advance Design, because they really came through for us. I loved that they had everything in house, anything you needed to have done, they could do it”.

Искусственно состаренный кирпич. Как состарить кирпич

[REQ_ERR: OPERATION_TIMEDOUT] [KTrafficClient] Something is wrong. Enable debug mode to see the reason.

На дно ниши слоем ,2 см укладываем раствор. Кирпич окунаем в воду, и на все грани, кроме нижней и лицевой, накладываем раствор. Устанавливаем камень в нишу и утапливаем, выравниваем его заподлицо со стеной постукиванием киянки по лицевой грани. Удаляем лишний раствор и расшиваем швы.

Затираем швы вокруг нового элемента влажной губкой. Инструкция на первый взгляд очень простая, но в процессе могут возникнуть сюрпризы с разрушением больших участков кладки. Если не уверены, что справитесь сами, лучше пригласить специалиста. Довольно часто ремонт кирпичной кладки зданий требует лишь восстановления швов и заделки мелких трещин. Чтобы сделать это, нужно максимально глубоко расшить их с помощью молотка и зубила, вычистить от грязи, смочить и заполнить свежим раствором.

Вопрос — каким именно? В этом случае, придется готовить аналогичный. Если же вы не смогли определить состав старого раствора, приготовьте смесь из следующих компонентов:. Или используйте глину, вдавливая её в швы деревянным бруском соответствующей толщины.

В случае с кладкой на цементном растворе, можно взять готовую цементно-клеевую смесь и добавить в неё немного гипса. Он компенсирует усадку швов и ускорит схватывание. Глубокие швы не стоит заполнять за один прием – лучше делать это поэтапно, дожидаясь схватывания каждого слоя. Лишний раствор с поверхности удаляется сразу, пока не схватился, с помощью мокрой губки.

По окончании ремонтных работ стены желательно обработать грунтовкой глубокого проникновения, лаком или другим защитным средством.

Кирпичная кладка может стать изюминкой интерьера, если немного над ней поработать. Среди вариантов её преображения, самыми популярными являются облицовка, покраска и искусственное состаривание.

Стены из старого кирпича обретают новое звучание. Раньше они прятались под декоративной отделкой, скрывая скромный, не слишком красивый внешний вид. Сегодня такие незамысловатые строительные материалы могут стать основным акцентом помещения. Как своими руками состарить новые кирпичные стены, подскажет статья. Старинная кирпичная кладка — это сильно поврежденная поверхность со:.

Выбор будет зависеть от изначального качества поверхности и стиля, в котором оформляется все помещение. Часто, даже после профессионального ремонта старая стена выглядит неприглядно, хотя к прочности претензий нет. В любом случае, способ существует, его используют и довольны получаемым эффектом.

И это всего лишь одна из возможностей уйти от типовых решений, а пользоваться ею или предпочесть другие материалы и технологии, личное дело каждого. И помните, всего лишь изменяя свое потребление – мы вместе изменяем мир!

Еще от forumhouse. Добавить комментарий. Утягиваем талию, укрепляем спину и поясницу: Всего 1 упражнение! Почему полнолуние 14 октября особенное и как себя вести. Завтра 14 октября Покров Пресвятой Богородицы. Почему возникают милиумы и что делать, чтобы не дать им испортить вам лицо. Благо Дарю Себе: Практика, которая изменит вашу жизнь! Совет Аюрведы: Если хотите иметь здоровую поджелудочную железу, ходите больше! Простой признак, что в доме есть негатив. Как материализуются наши мысли: 7 секретов силы притяжения.

Люди считают себя гораздо менее ценными и нужными, чем они есть на самом деле. Радует – не радует: Простой способ навести порядок в своей жизни. Опавшие листья на даче: лучшие варианты использования природного материала.

Как оставаться спокойным в любой ситуации: 10 техник. Как избавиться от тараканов быстро и навсегда: Простое решение неприятной проблемы. Пожиратели энергии: 6 вещей, на которые не стоит тратить нервы.

Экспресс-подтяжка лица, которую вы можете сделать самостоятельно. Усадьба Бытовая техника Дизайн интерьера. Искусственно состаренный кирпич — бюджетный вариант.

После высыхания нанесенная декоративная смесь образует на поверхности пленку, которая обеспечивает высокие эксплуатационные характеристики покрытия и его стойкость к механическим воздействиям. Кроме того, такая штукатурка:. Нанесение штукатурки под старину — достаточно сложный процесс, поэтому выполнение работы лучше доверить профессиональному мастеру.

Конечный результат будет зависеть не только от качества штукатурной смеси, но и от умения специалиста. Как правило, чтобы получить эффект состаренных стен, штукатурка наносится такими же способами, как и при обычном окрашивании: валиком, кистью и т.

Однако предпочтение отдается кисти с длинным ворсом. На поверхность состав наносится круговыми движениями. Предварительный эффект неровности создается в результате неравномерного надавливания на кисть.

Далее поверхность затирается щеткой, губкой или тканью. После высыхания штукатурка обрабатывается воском, который сглаживает шершавость и придает поверхности блеск. Для патинирования штукатурки хорошо подходит краска с эффектом металла для стен.

Перед началом работ подготавливается поверхность.

Тема в разделе ” Строительные блоки, плиты, кирпич “, создана пользователем Андрейgas , Искать только в заголовках Сообщения пользователя: Имена участников разделяйте запятой. Новее чем: Искать только в этой теме Искать только в этом разделе Отображать результаты в виде тем.

Она должна быть чистой, ровной и обязательно сухой, не иметь трещин, ярко выраженных вмятин, других дефектов. Малярным скотчем оклеиваются все примыкающие поверхности.

Как с минимальными вложениями получить имитацию старой кладки.

Стена в один-два слоя обрабатывается специальной грунтовкой, для высыхания которой потребуется до четырех часов. Нанесение раствора на поверхность осуществляется круговыми движениями, чаще всего при помощи кисти с длинным ворсом.

Как вариант — наносится еще слой другого оттенка. Поверхность должна высохнуть, для этого потребуется от шести до двенадцати часов. Далее при помощи мелкой наждачной бумаги или губки выполняется затирка поверхности.

Чтобы добиться гладкого сияющего вида, используется воск, который можно колеровать в нужный цвет.

Что такое состаренный кирпич?

Воск наносится губкой или кисточкой равномерными растирающими круговыми или разнонаправленными движениями до получения нужного результата. Штукатурка стен под старину наносится с использованием разных техник, поэтому для выполнения работ понадобится как стандартный набор инструментов, так и специальные приспособления:.

Если штукатурные работы выполняются регулярно, лучше обзавестись рельефными валиками с долговечным покрытием из тефлона или полиэстера. Для выполнения разовых самостоятельных работ можно обойтись дешевым инструментом из полиэтилена. Выбирая губку для растирки нужно учитывать, что при элитной отделке штукатурку лучше обрабатывать натуральными морскими губками.

Однако они имеют высокую стоимость, поэтому на практике часто используют двухслойную кухонную губку для мытья посуды. Черновые работы выполняют стороной с жесткой волокнистой поверхностью, для чистовой отделки применяют мягкую поверхность из поролона. Для отделки стен внутри помещений используется венецианская штукатурка под старину. В нее входят различные компоненты, с помощью которых можно воссоздать богатые текстуры и эффекты:.

Высокие эксплуатационные характеристики декоративной венецианской штукатурки объясняют востребованность строительной смеси при оформлении:.

Как состарить кирпич своими руками

Интерьер, оформленный с использованием венецианской штукатурки, будет длительное время сохранять привлекательный вид. В настоящее время краска как средство отделки и украшения элементов интерьера оттеснила на второй план даже столь популярные обои.

Стоит ли удивляться, ведь множество вариантов нанесения краски позволяет создать оригинальный и неповторимый дизайн помещения.

А благодаря доступности материала и простоте его использования, созданием декоративных эффектов могут заниматься даже те, кто не обладает какими-либо специальными познаниями в этой области. Художником может стать каждый! Подготовка к работе Для начала необходимо определиться в своих желаниях и продумать, какого эффекта и в каком именно месте вы хотите добиться.

Для чего делают

Какая краска подойдет для этого лучше всего. И что еще может понадобиться для работы. Выбирая цвет краски, следует помнить о том, что темные приглушенные оттенки не только создают уют, но и несколько сужают пространство. А холодные, напротив, освежая помещение, одновременно визуально расширяют его границы. Также следует предварительно продумать, где будут находиться источники света.

Тон краски меняется в зависимости от типа освещения искусственное или естественное , от близости осветительных приборов к рабочей зоне. И помните: чем больше размер вашего творения, тем ярче на нем будет смотреться цвет. Теперь можно приступать непосредственно к декору.

Создание декоративных эффектов Приемов, позволяющих разнообразить скучную монотонную поверхность — великое множество. С их помощью можно создать как довольно спокойную полосатую стену, так и воздвигнуть надежную кирпичную кладку.

Как облагородить кирпичную стену: 3 способа обновить и видоизменить кладку

Используя различные инструменты, можно нарисовать на потолке своей спальни романтичное звездное небо или же украсить часть стены гостиной имитацией крокодиловой кожи. Возможности краски и способов ее нанесения практически безграничны! Простейший из приемов декоративной покраски — это декорирование эффектом наката.

Суть данного способа заключается в нанесении более темной или яркой краски с помощью специального фигурного валика на более светлый и спокойный первый слой. При этом в краску для нанесения узора добавляется глазурь, а зачастую и художественные краски. Подобным же образом используются и различные трафареты. На первый высохший слой путем приложения к нему трафарета наносится рисунок краской другого цвета. Такие заготовки можно изготовить самостоятельно, перенеся на поверхность будущего трафарета понравившийся узор и вырезав его по контуру.

Состаривание кирпича

Такая отделка отличается не только высокой эстетичностью, но и практичностью. Краска не выгорает, не царапается и защищена от потертостей. Крашеные стены характеризуются довольно длительным сроком эксплуатации. Не требуют какого-то особого ухода, достаточно простой влажной уборки.

Декоративное окрашивание безвредно и универсально, оно подходит практически для любых поверхностей и помещений. Стоит только проявить фантазию, приложить немного усилий — и ваши квартира, дом, офис преобразятся. Стены расцветут интересным, замысловатым узором, подчеркивая ваш вкус. Творите и создавайте окружающее вас пространство самостоятельно!

Если вы любитель старых вещей или вам просто не на что обновить интерьер в своем доме, вам легко можно воспользоваться способом покраски под старину. К покраске под старину подходит большое количество вещей. Это и мебель, и стены, и двери. В общем, все, что придает вашему дому определенный стиль.

Биологи смогли искусственно состарить мышь, воздействуя на генетический механизм

Американские, японские и британские биологи обнаружили в геноме мыши особый механизм, включение которого привело к превращению здоровых мускулов молодого грызуна в дряблые старческие мышцы, и опубликовали результаты своих экспериментов в статье в журнале Cell.

Геном человека и других животных содержит в себе огромное количество “инструкций”, управляющих работой организма во время роста, нормальной жизнедеятельности и старения. Считается, что изучение генетических механизмов, включающихся во время старости, поможет продлить жизнь и молодость. За последние два десятилетия ученые выделили множество генов, отвечающих за эти процессы, однако ни один из них не подходит на роль главного “гена старости” или “вечной молодости”.

Группа биологов под руководством Иссэя Комуро (Issei Komuro) из университета Осаки (Япония) обнаружила один из ключевых элементов, управляющих процессом старения, изучая работу двух сложных генетических механизмов – так называемой системы Wnt и белкового комплекса C1q.

Как объясняют исследователи, работа этих клеточных механизмов обеспечивается несколькими десятками генов и белков, передающих, обрабатывающих и реагирующих на химические сигналы. Система Wnt управляет развитием организма во время взросления, а поломки в ней являются одной из основных причин появления раковых клеток. Белковый комплекс С1q задействован в работе иммунной системы, однако не все его функции известны ученым.

В 2007 году сразу несколько групп биологов заметило, что система Wnt играет существенную роль в старении организма млекопитающих. В частности, подавление активности Wnt “вернуло” молодость костным тканям и мускулам пожилых мышей. Тем не менее, механизмы, управляющие работой этой системы, оставались загадкой до настоящего времени.

Комуро и его коллеги заметили, что рост активности Wnt в клетках пожилых мышей сопровождается ростом концентрации белка C1q. Они предположили, что именно это вещество активирует систему Wnt и запускает механизм старения.

Для проверки этого предположения биологи вырастили культуры мускулов человека и мышей и добавили в питательную среду большое количество молекул С1q. Через несколько часов после начала эксперимента ученые заметили, что молекулы белкового комплекса соединились с одним из компонентов системы Wnt – рецепторами Fz на поверхности клеток.

По словам ученых, повышение концентрации молекул C1q в питательном растворе приводило к росту активности Wnt в клетках, что подтвердило догадку биологов. Убедившись в истинности гипотезы, биологи попытались искусственно состарить мускулы молодой мыши в мышцы пожилого грызуна.

Авторы статьи приобрели нескольких молодых мышей и разделили их на две группы. Грызунам из первой группы наклеили на ноги гелевый пластырь, пропитанный молекулами белкового комплекса, а вторая группа стала контрольной.

Через несколько дней биологи обожгли ноги своих подопечных при помощи жидкого азота и оценили скорость восстановления ран. Оказалось, что мускулы мышей с пластырем восстанавливались крайне медленно, а их структура была больше похожа на мышцы пожилых, а не молодых грызунов. Мышцы животных из контрольной группы восстанавливались нормальными темпами.

Комуро и его коллеги полагают, что их открытие поможет разработать лекарства, подавляющие активность системы Wnt.

“Задача заключается в том, чтобы новое лекарство против старения подавляло только деятельность комплекса C1q, доля которого повышается в клетках организма по мере старения. Результаты нашего исследования еще на шаг приблизили реализацию мечты человечества – предотвращения старения”, – заявил Комуро в интервью японскому агентству Киодо.

Источник: РИА Новости

Лист алюминиевый 3 мм В95А ГОСТ 21631-76 закаленный и искусственно состаренный

Компания ТОО “Снабтехмет” предоставляет возможность купить лист алюминиевый 3 мм В95А ГОСТ 21631-76 закаленный и искусственно состаренный по цене производителя. Для оформления заказа воспользуйтесь формой заявки на нашем сайте, или позвоните по указанному номеру. Осуществляем доставку по всему Казахстану и в соседние страны.

Лист алюминиевый – это плоское и широкое изделие цветного металлопроката, производится из сплавов алюминия методом горячей деформации и холодной прокатки.

Мы изготавливаем листы из качественного сырья, все стороны обрезаем под прямым углом и обтачиваем. Также листы дополнительно подвергаются термической обработке:

  • закаливаются;
  • искусственно составиваются;
  • легируются кремнием, марганцем, никелем и т.п.

Разновидность алюминиевых листов ГОСТ 21631-76 по виду поверхности:

  • гладкие;
  • перфорированные;
  • профилированные;
  • рифлёные;
  • антискользящие;
  • гофрированные.

По методу изготовления листы бывают:

  • без плакировки;
  • c нормальной плакировкой;
  • технологической плакировкой;

Основные преимущества листа из алюминия В95А:

  • долговечность;
  • устойчивость к коррозии;
  • огнеупорность;
  • высокая прочность;
  • небольшой вес.

Сферы применения алюминиевых листов:

  • авиастроение;
  • машиностроение;
  • пищевая и химическая промышленность;
  • строительство.

Из листов изготавливают

  • дорожные знаки;
  • указатели;
  • рекламные носители;
  • оконные блоки;
  • рефрижераторное оборудование;
  • топливные и пищевые ёмкости.

Основные характеристики.

Характеристика

Значение

Материал

Алюминиевый деформируемый сплав (нормальная плакировка)

Марка материала

В95А

Размер, мм

3

НТД

ГОСТ 21631-76

Данный прайс-лист носит исключительно информационный характер и ни при каких условиях не является публичной офертой, определяемой положениями ст. 447 Гражданского кодекса Республики Казахстан.

Что такое старение металла? | Металлические супермаркеты

Старение металла — один из наиболее распространенных способов изменения свойств металлического сплава. В то время как многие металлы могут изменить свои свойства в результате нагревания и закалки или деформационного упрочнения, некоторые металлические сплавы специально разработаны для старения. Старение может изменить физические и эстетические свойства сплава, придав ему характеристики, совершенно отличные от его несостаренной формы.

Что такое старение металла?

Старение металла — это процесс, используемый для металлических сплавов, подвергнутых термообработке на твердый раствор, который может быть осуществлен искусственно или происходить естественным путем.Естественное старение происходит на протяжении всего срока службы металлического сплава. В процессе естественного старения перенасыщенные легирующие элементы в металлическом сплаве образуют так называемые металлические осадки. Эти осадки блокируют дислокации в металле, повышая прочность и твердость металлического сплава и снижая его пластичность. Искусственное старение — это процесс, который используется для ускорения образования осадков в металлическом сплаве, прошедшем термообработку на твердый раствор, до скорости, которая намного превышает скорость естественного процесса старения.Процесс искусственного старения осуществляется путем повышения температуры металлического сплава, прошедшего термообработку на твердый раствор, до точки ниже температуры его рекристаллизации, но достаточно высокой, чтобы ускорить образование осадка. Как только выделения легирующих элементов приобретают нужный размер, металлический сплав затем быстро охлаждают, чтобы предотвратить дальнейшее изменение выделений металла.

Какие типы металлов можно состарить?

Существует много типов металлических сплавов, которые можно подвергать старению для изменения их физических свойств, если они поддаются термообработке на твердый раствор:

Алюминий: Серии алюминиевых сплавов 2XXX, 6XXX и 7XXX поддаются старению, и многие из их различных форм получают свою прочность за счет искусственного старения.Одним из наиболее распространенных состаренных алюминиевых сплавов является 6061-Т6. Он имеет осадки силицида магния, которые блокируют дислокации и значительно увеличивают его прочность и твердость в форме -T6.

Нержавеющая сталь: 17/10P, 17/4PH и 17/7PH — это несколько распространенных сплавов нержавеющей стали, которые обладают чрезвычайно высокой прочностью и твердостью при надлежащем старении из-за осаждения металлического сплава в их структуре.

Медные сплавы: C17200 и C17300 — два медно-бериллиевых сплава, которые часто используются в промышленности.Обычно известная своей мягкостью и пластичностью, медь может быть довольно твердой, прочной и хрупкой, если используются правильные добавки легирующих элементов с надлежащей техникой старения.

Другие металлические сплавы: Титан, никель и магний, а также некоторые другие металлы могут подвергаться старению, если в их химическом составе есть легирующие элементы, которые делают их пригодными для термообработки на твердый раствор.

Перестаривание

Одной из проблем при старении металлического сплава, естественном или искусственном, является то, что известно как перестаривание.Это происходит, когда преципитаты изменяются в размере из-за процесса старения, который выполняется за пределами полезного для применения. Это часто приводит к снижению прочности и твердости. Это происходит двумя распространенными способами: сваркой или холодной обработкой металла. Следует проявлять осторожность, чтобы определить, нужно ли снова искусственно состаривать металл, подвергаемый термообработке на твердый раствор, после одного из этих двух процессов, чтобы гарантировать сохранение желаемых механических свойств.

Металлические супермаркеты

Metal Supermarkets — крупнейший в мире поставщик мелких партий металла с более чем 100 обычными магазинами в США, Канаде и Великобритании.Мы являемся экспертами в области металлов и предоставляем качественное обслуживание клиентов и продукцию с 1985 года.

В супермаркетах металлов мы поставляем широкий ассортимент металлов для различных применений. Наш склад включает в себя: мягкую сталь, нержавеющую сталь, алюминий, инструментальную сталь, легированную сталь, латунь, бронзу и медь.

У нас есть широкий ассортимент форм, включая стержни, трубы, листы, пластины и многое другое. И мы можем порезать металл по вашим точным спецификациям.

Посетите сегодня один из наших более чем 100 офисов в Северной Америке.

Колонка

: Будут ли когда-нибудь популярны «виски» с искусственной выдержкой? Это уже происходит

Несколько лет назад я получил одну из первых бутылок Glyph, отправленных в Великобританию, где я живу. Glyph — это виски, производимый компанией Endless West из Сан-Франциско. Компания отказывается от типичных дорогостоящих усилий по ферментации, дистилляции и созреванию. Вместо этого он самостоятельно получает молекулярные соединения, обычно встречающиеся в хорошем виски.Смешивая их вместе, получающийся напиток теоретически напоминает выдержанный виски по запаху и вкусу.

Попробовав Glyph в превосходном виски-баре Milroy’s of Soho, я и мой друг из индустрии виски (Билли Эбботт из The Whiskey Exchange) пришли к такому же выводу. Хотя теория этого продукта увлекательна, на практике он не очень вкусен. Тем не менее, Glyph представляет собой очень интересную раннюю попытку обойти проверенные и проверенные методы производства виски.

Endless West — не первая компания, которая ищет короткие пути. Однако, в отличие от Glyph, большинство его конкурентов сосредоточены на инновационных методах, позволяющих резко сократить период созревания, а не на изобретении велосипеда. Cleveland Whiskey использует специальный метод создания давления в стальном резервуаре, чтобы наполнить виски шестимесячной выдержки ароматом. Еще одним пионером в игре с быстрым старением является Брайан Дэвис, основатель винокурни Lost Spirits Distillery. Он построил специализированные реакторы, которые создают действительно вкусные спиртные напитки.

Глиф (изображение через Endless West)

Это не единственные компании, выпускающие виски искусственной выдержки. Новая волна формируется отчасти благодаря знаменитостям, связанным с компаниями, производящими эти бренды.

Член Зала славы НФЛ Чарльз Вудсон основал компанию Woodson Bourbon, которая использует звуковые волны для созревания собственного виски шестимесячной выдержки. Музыкант Йелавольф дал свое имя виски Creek River, который создается компанией Next Century Spirits. Эта компания добивается быстрой выдержки, добавляя в свой виски древесную стружку из бывших винных бочек.Он также создает виски в короткие сроки для всех, кто хочет создать новый бренд. Компания Bespoken Spirits, одним из инвесторов которой является Дерек Джетер, предлагает аналогичную услугу по созданию виски быстрой выдержки с использованием собственной технологии.

Типичный поклонник виски может насмехаться над мыслью, что у любого из этих выскочек когда-нибудь появится шанс разрушить известные бренды шотландского, бурбона, ржаного виски или виски из Теннесси. Однако, похоже, некоторым компаниям удается создавать действительно вкусные продукты.В своем посте на Forbes писатель и историк виски Фред Минник похвалил и Вудсона, и Крик Ривер. Уважаемый испанский блогер по виски Эмма Брионес восхваляет искусственно выдержанный «спирт», сделанный в Дании, EtOH Spirits. Здесь комбинация давления реактора и ультразвуковых волн запускает процесс «созревания».

Более того, некоторые из этих компаний утверждают, что их производственные процессы намного более экологичны. Они выделяют часть выбросов углерода и производят меньше отходов, чем спиртзаводы, производящие эквивалентное количество самогона.

Стоит также отметить, что искусственное созревание, похоже, является почти исключительно американской тенденцией. В Великобритании и Европе требуется минимум 3 года созревания, а это означает, что любые молодые претенденты будут страдать от последствий ярлыка, если они будут продолжать такие эксперименты по быстрому старению. Закон более смягчен в отношении того, что можно назвать «виски» в США, поэтому дальнейшие прорывы в технологии и вкусе, скорее всего, будут американскими.

Маловероятно, что эти бренды в ближайшее время окажут серьезное влияние на общий мировой рынок виски.Но для многих из этих методов искусственного созревания еще рано. Они могут масштабироваться и стать более рентабельными. Многие из этих продуктов сейчас находятся в той же ценовой категории, что и недорогие высококачественные виски. Как только производители «традиционного» виски сохранят хороший вкус и снизят цены на бутылки, им, возможно, придется начать оглядываться назад.

Эти ликеро-водочные заводы используют науку для искусственного старения виски – отчет Робба

Что-то происходит на берегу реки Кентукки.В закопченном здании под названием Warehouse P проводится эксперимент: сотни бочек, наполненных бурбоном и виски, лежат сонные рядами. Температура постоянно холодная 45 градусов. И время, кажется, замедляется.

Warehouse P — дитя любви Buffalo Trace (также известного как производитель некоторых из наших любимых виски, таких как Pappy Van Winkle) и Last Drop Distillers, лондонской алкогольной компании, которая специализируется на раскопках старых и редких бочек. Дуэт собрался на Франкфуртском нагорье с общей целью: передать прохладные условия Шотландии, идеально подходящие для медленного и равномерного созревания виски, американским спиртным напиткам.

Резкие температуры Кентукки, которые колеблются между 100 градусами летом и 0 градусов зимой, оказывают ртутное воздействие на процесс старения спиртных напитков. Теплая погода втягивает оставшуюся жидкость глубоко в клепки бочки, открывая ей характер дерева, в то время как холодная погода выталкивает жидкость обратно, наполняя ее ароматом дуба. Постоянно меняющаяся алхимия делает перестаривание рискованным, и именно по этой причине большинство бурбонов выдерживается от четырех до 12 лет.Однако, регулируя температуру круглый год, Warehouse P может производить самый старый виски в американской истории.

«Американских бурбонов, выдержанных до 50 лет, просто не существует», — говорит Ребекка Джаго, содиректор Last Drop. «Мы надеемся достичь того, что раньше было невозможно: выдержанный, высококачественный и вкусный американский виски». Терпение, без сомнения, потребуется в этом длительном (и дорогостоящем) испытании: Last Drop не собирается выпускать свою первую бутылку в течение как минимум 25 лет, и можно только догадываться, каким он будет на вкус.Джаго говорит: «Это явно эксперимент, поэтому результат не может быть гарантирован».

Израильская компания Milk & Honey быстро справляется со стареющими спиртными напитками. Дэниел Бар-Он

Последняя капля — не единственный сумасшедший ученый в духах. Другие производители переделывают процесс выдержки с обратным намерением: выдержать виски всего за несколько лет или несколько минут. Находясь на полпути в Израиле, компания Milk & Honey делает ставку на то, что в жарком и влажном климате Тель-Авива можно произвести (почти) настоящий виски в рекордно короткие сроки.В прошлом году его молодой односолодовый виски, созревавший месяцами, а не годами, занял второе место на выставке Whiskey Live Tel Aviv. Награжденный спирт настолько молод, что его даже технически нельзя назвать виски — этот термин зарезервирован для жидкостей, выдержанных не менее трех лет, — но тем не менее его дымный, сложный вкус завоевал поклонников.

Тем временем на территорию научных выставок выходят виски и бурбоны Криса Менденхолла, которые мастер-миксолог «выдерживает» в баре Quadrant отеля Ritz-Carlton, Вашингтон, округ Колумбия, используя звуковые волны.«Я обнаружил, что звуковые волны могут ускорять старение», — говорит он, объясняя, что волны «проталкивают» жидкость через древесину бочек, чтобы изменить качества духа. «Это привело меня к изучению ликероводочных заводов и производителей виски, которые используют передовые технологии, такие как давление и звуковые волны, для ускорения процесса старения». Первый релиз Менденхолла, Bourbon Style #1, представляет собой 120-градусный 9-летний бурбон из Кентукки, «базовый спирт», который подвергался воздействию 20 000 импульсов в секунду в течение 30 минут с 1977 по 1989 год в его специальном гомогенизаторе.В результате получается более богатый и округлый спирт, вкус которого старше его возраста.

Конечно, не все согласны с этими энергичными экспериментами. Сторонники бурбона и виски, не говоря уже о таких организациях, как Совет США по производству дистиллированных спиртных напитков (DISCUS), по-прежнему скептически относятся к тому, что процессом старения можно — или нужно — управлять. «В течение многих лет люди пытались ускорить процесс старения, потому что время — деньги», — говорит Фрэнк Коулман, старший вице-президент DISCUS.«Но большинство из них не увенчались успехом, потому что мы говорим о естественном процессе».

Тем не менее, мы поднимаем бокал за дух приключений.

границ | Физиологический и протеомный анализ искусственно состаренных семян Brassica napus

Введение

Успешное прорастание семян является предпосылкой для начала жизненного цикла растений и распространения своего потомства и в значительной степени определяется энергией семян (Holdsworth et al., 2008; Rajjou et al., 2012). Старение семян — это процесс, который приводит к задержке прорастания, снижению скорости прорастания, а иногда даже к полной потере жизнеспособности семян (Priestley, 1986). Длительное хранение семян вызывает их старение, что является серьезной проблемой при сохранении зародышевой плазмы растений (Garza-Caligaris et al., 2012). В сельском хозяйстве вызревшие семена сельскохозяйственных культур плохо прорастают и отрицательно сказываются на росте всходов и, в конечном итоге, на урожайности (Ellis, 1992). При хранении в неконтролируемых условиях большинство сельскохозяйственных культур имеют всхожесть семян от 1 до 5 лет, что значительно меньше по сравнению с дикорастущими растениями.Доказано, что оптимизированные условия хранения способствуют замедлению скорости старения семян и, в конечном итоге, увеличению продолжительности жизни семян. Для ортодоксальных семян полезна низкая температура и влажность (Walters et al., 2005), тогда как высокая температура и влажность вызывают и ускоряют процесс старения семян (El-Maarouf-Bouteau et al., 2011).

Старение семян приводит к различным клеточным и метаболическим изменениям, включая потерю целостности мембран, деградацию ДНК, снижение первичного метаболизма и так далее (Corbineau et al., 2002; Кибинза и др., 2006; Эль-Мааруф-Буто и др., 2011). Хотя зрелые семена находятся в состоянии физиологического покоя, они не могут предотвратить образование активных форм кислорода (АФК). Предполагается, что избыточное накопление АФК и их воздействие на липиды и белки являются основной причиной старения семян (Bailly, 2004). АФК приводят к перекисному окислению и деградации липидов, что в конечном итоге нарушает целостность клеточных мембран (Lee et al., 2012; Parkhey et al., 2012). Обычно АФК рассматриваются как основной фактор, приводящий к старению семян при хранении (Priestley, 1986).Показано, что накопление перекиси водорода связано с потерей жизнеспособности семян подсолнечника (Bailly et al., 1996; Kibinza et al., 2006). В условиях стресса АФК способствуют программной гибели клеток (ПКС) как у растений, так и у животных (Grant and Loake, 2000; Neill et al., 2002). Однако до сих пор неизвестно, индуцируется ли старение семян также АФК через запуск ПКС или нет.

Старение семян тесно связано с условиями хранения, однако недавние исследования показали, что семена разных видов растений демонстрируют разную скорость старения семян при одинаковых условиях хранения (Walters et al., 2005). Считается, что жизнеспособность семян определяется их генетическим фоном, а также условиями хранения (Bewley, 1997; Miura et al., 2002; Clerkx et al., 2004). У Arabidopsis гены, участвующие в биосинтезе флавоноидов и токоферолов, могут способствовать долговечности семян (Debeaujon et al., 2000; Sattler et al., 2004). Кроме того, связанный с покоем ген задерживал прорастание 1 ( DOG1 ) (Bentsink et al., 2006) и фактор транскрипции, чувствительный к тепловому стрессу (Prieto-Dapena et al., 2006) также улучшают устойчивость к старению. Недавние исследования подтвердили, что метионинсульфоксидредуктазы из Medicago truncatula и протеин L-изоаспартилметилтрансфераза (PIMT) из арабидопсиса и лотоса ( Nelumbo nucifera ) могут повышать силу и долговечность семян (Oge et al., 2008; Chatelain et al. ., 2013; Верма и др., 2013). С развитием геномики и других крупномасштабных методов «омики» за последнее десятилетие был проведен ряд транскриптомных и протеомных исследований с целью выявления и характеристики потенциальных биомаркеров старения семян (Nakabayashi et al., 2005; Раджоу и др., 2008).

Brassica napus является одним из основных источников пищевого масла во всем мире. Однако семян B. napus собирают поздней весной, а их хранение переходят на летний период, что приводит к потере их всхожести. Таким образом, имеет большое практическое значение предотвращение потери энергии семян, для чего необходимо получить всестороннее представление о механизмах, лежащих в основе старения семян. К сожалению, исследование на эту тему в г.napus довольно слабый. В этом исследовании мы подвергли семян B. napus воздействию высокой температуры и влажности и провели сравнительный протеомный анализ контрольных и искусственно состаренных семян, чтобы понять лежащие в их основе механизмы. Было идентифицировано много дифференциально накапливаемых белков, которые отличались от предыдущих исследований на других растениях. Наши результаты дают новое представление о механизмах старения семян B. napus .

Материалы и методы

Рост растений, обработка старением и анализы прорастания

Б.napus (zhongshuang11) выращивали в теплице в условиях естественного освещения в Ухане, Китай. Семена, не находящиеся в состоянии покоя, собирали в мае каждого года и использовали в качестве экспериментального материала. Свежесобранные семян B. napus обрабатывали высокой температурой и влажностью в соответствии с Rajjou et al. (2008) с небольшими изменениями. Вкратце, семена подвергали воздействию температуры 40°С и влажности воздуха 90% в разные моменты времени (0, 12, 24 и 48 ч). Семена, хранившиеся при комнатной температуре в герметичном полиэтиленовом пакете, в сухих условиях в течение 1 года, использовали как семена естественного созревания.

Необработанные и обработанные семена сушили в духовке при 40°C в течение ночи, а затем погружали в дистиллированную воду при 26°C в темноте для прорастания. Всхожесть для каждого образца рассчитывали через каждые 6 ч до прекращения прорастания семян. Для экспериментов по обработке абсцизовой кислотой (АБК) и извлечению гибберелловой кислоты (ГК) семена пропитывали растворами 10 -8 М АБК и 10 -7 М GA 3 во время прорастания соответственно. Для каждой обработки выполняли три биологические повторности, а также анализ всхожести с 50 семенами в каждом наборе повторности.Схематическая блок-схема всего эксперимента показана на рисунке S1.

Измерение утечки ионов, содержания малонового диальдегида и перекиси водорода

Утечка ионов была рассчитана, как описано ранее (Shi et al., 2012), путем измерения относительной проводимости образцов. Вкратце, 0,1 г семян обоих образцов при 0 ч прорастания инкубировали в 6 мл дистиллированной воды в течение 4 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. После инкубации измеряли начальную проводимость (C1) раствора.Конечную электропроводность (С2) раствора измеряли после кипячения семян в течение 30 мин и охлаждения раствора до комнатной температуры. REL рассчитывали как процент электропроводности до и после кипячения [(C1/C2) × 100] с использованием измерителя электропроводности (Leici-DDS-307A, Shanghai Precision Scientific Instrument Company, Шанхай, Китай).

Содержание малонового диальдегида (МДА) измеряли с использованием коммерческого набора (S0131, Beyotime, Нанкин, Китай) в соответствии с протоколом производителя, который основан на реакции между МДА и тиобарбитуровой кислотой с образованием соединения красного цвета.Вкратце, 0,2 г семян гомогенизировали с 2 мл охлажденного льдом фосфатного буфера и центрифугировали при 1600 × г в течение 10 мин при 4°С. Затем надосадочную жидкость смешивали с равным объемом 0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты. Смесь кипятили 10 мин. После охлаждения водой до комнатной температуры смесь центрифугировали при 3000× g в течение 15 мин при комнатной температуре. Поглощение супернатанта определяли при 530 нм. Концентрацию МДА рассчитывали по стандартной кривой, построенной с использованием известных концентраций МДА.

Измерение H 2 O 2 проводилось в соответствии с методом, описанным ранее (Jaw-Neng Lin, 1998). Вкратце, 0,1 г семян гомогенизировали в буфере PBS и центрифугировали при 12000 × г в течение 20 мин при 4°C. Супернатант смешивали с равным объемом 0,1% сульфата титана в 20% H 2 SO 4 (об./об.) и снова центрифугировали при 6000 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Поглощение супернатанта измеряли при 410 нм.Концентрацию H 2 O 2 рассчитывали на основании стандартной кривой, построенной для ряда растворов H 2 O 2 с известной концентрацией. Все измерения проводились в трех биологических повторностях.

Измерение содержания абсцизовой кислоты

Концентрацию

АБК измеряли с использованием метода дериватизации в сочетании с нано-ЖХ-ESI-Q-TOF-MS (Bruker Daltonics, Бремен, Германия), как описано ранее (Chen et al., 2012). Вкратце, 0,1 мг семян гомогенизировали в жидком азоте, а затем переносили порошок в центрифужную пробирку на 2 мл с последующей экстракцией 500 мкл модифицированного растворителя Биелески (метанол/вода/муравьиная кислота, 15/4/1, объем/объем). /v) добавляли к нему и смесь инкубировали при 4°C в течение 12 часов. Стабильный изотоп, помеченный АБК ([ 2 H 6 ] АБК, 50 нг/г), добавляли к каждому из образцов, чтобы они служили внутренними стандартами для количественного определения. Затем супернатанты последовательно пропускали через картриджи тандемной твердофазной экстракции (ТФЭ), содержащие адсорбент С18 (50 мг) и адсорбент ПАХ (200 мг).Перед экстракцией ТФЭ тандемные картриджи предварительно кондиционировали 8 мл H 2 O, 8 мл метанола и 8 мл модифицированного растворителя Биелески. После загрузки образца картридж C18 удаляли, а картридж SAX промывали 2 мл метанола/H 2 O (20/80, об./об.). После этого для элюирования целевой АБК применяли 3 мл ацетонитрила (CAN) с 1% плавиковой кислотой (FA) (об./об.), элюент выпаривали в токе слабого азота при 35°C с последующим повторным растворением в 100 мкл. Н 2 О.Полученный раствор (100 мкл) затем подкисляли 10 мкл ФК и экстрагировали эфиром (2 х 1 мл). Эфирную фазу объединяли, сушили в атмосфере азота и восстанавливали в 100 мкл ACN. К полученному раствору добавляли 10 мкл триэтиламина (ТЭА) (20 мкмоль/мл) и 10 мкл бромида 3-бромактонилтриметиламмония (БТА) (20 мкмоль/мл). Реакционный раствор встряхивали в течение 30 мин при 35°C и выпаривали в атмосфере азота с последующим повторным растворением в 200 мкл H 2 O/ACN (90/10, об./об.) для инструментального анализа.Калибровочную кривую строили путем сравнения соотношения площадей пиков (аналит/IS) с концентрациями. Содержание АБК рассчитывали по калибровочной кривой. Было проведено три биологических повтора.

Анализы активности супероксиддисмутазы и каталазы

Общую активность супероксиддисмутазы (СОД) измеряли с использованием коммерческого набора WST-1 (S0102, Beyotime) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, семена измельчали ​​с использованием жидкого азота, а затем гомогенизировали в фосфатно-сбалансированном растворе-буфере (PBS, pH 7.5). Смесь центрифугировали при 12 000 × g при 4°С в течение 15 мин. Полученный таким образом супернатант использовали для измерения активности СОД. Принцип этого метода заключался в сочетании 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,16-4-дисульфофенил)-2H-тетразолия (WST-1) с ксантиноксидазой (XO ) для получения O 2- и формазанового красителя, который может быть ингибирован SOD путем катализа O 2- в H 2 O 2 и O 2 . Активность СОД можно рассчитать, определив оптическую плотность формазанового красителя при 450 нм.

Каталазную (CAT) активность

анализировали с использованием коммерческого набора (S0051, Beyotime), как описано ранее (Shi et al., 2012). Вкратце, 10 мкл 250 мМ H 2 O 2 смешивали с 5 мкл белкового супернатанта. H 2 O 2 разлагали с помощью CAT в течение 5 мин, а оставшийся H 2 O 2 , связанный с субстратом, обрабатывали пероксидазой (POD) с образованием N-4-антипирил-3-хлор. -5-сульфонат-п-бензохинонмоноимин. Активность CAT определяли путем расчета скорости разложения H 2 O 2 при 520 нм.Оба фермента анализировали в трех повторностях.

Экстракция белков и двумерный электрофорез

Белки

экстрагировали из семян B. napus через 0 и 18 ч после набухания по методике, описанной ранее (Chi et al., 2010). Вкратце, 0,2 г семян гомогенизировали в ледяном буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl (рН 7,5), 250 мМ сахарозы, 10 мМ этиленбис(оксиэтиленнитрило)тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1 мМ фенилметансульфонилфторида (ФМСФ), 1 мМ DL-дитиотреитол (DTT) и 1% Triton X-100.Гомогенат центрифугировали при 12000× g в течение 30 мин при 4°С. Супернатант смешивали с изометрическим трис-фенолом (рН 7,8) и встряхивали в течение 20 мин. Затем смесь центрифугировали при 12000× g в течение 15 мин при 4°С. После центрифугирования собирали надосадочную фенольную фазу и промежуточный слой денатурированного белка. Затем фенольную фазу, содержащую белки, смешивали с 5 объемами 0,1 М ацетата аммония в метаноле и инкубировали при -20°С в течение ночи. Осадок, полученный после центрифугирования при 12000× g в течение 30 мин, промывали 4 раза ледяным ацетоном и сушили в вакууме.Для двумерного электрофореза (2-DE) высушенные осадки белков растворяли в регидратационном буфере, содержащем 7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]пропансульфоната (CHAPS), 0,2% носителя амфолита. и 65 мМ ДТТ, и количественно определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976; Kruger, 1994). В общей сложности 600 мкг белков каждого образца наносили на 17-см полоску IPG путем регидратации в течение 12 ч при комнатной температуре. На основании первичного скрининга в данном исследовании были отобраны полоски ИФЗ с рН 5–8 (линейный).Изоэлектрофокусировку (ИЭФ) проводили при 200, 500 и 8000 В в течение 1, 1,5 и 10,5 ч соответственно (He et al., 2011). После ИЭФ полоски инкубировали в уравновешивающем буфере, содержащем 0,05 М Трис-HCl pH 6,8, 2,5% ДСН, 10% (об/об) глицерина и 2% ДТТ, и встряхивали в течение 15 мин, а затем еще 15 мин с йодацетамидом. заменен уравновешивающий буфер DTT. Двухмерное разделение белков проводили на 12% SDS-PAGE (Li et al., 2012).

Гелевое окрашивание, сканирование и анализ

Гели окрашивали кумасси бриллиантовым сине-красным (CBB-R) 250 в течение 40 мин, а затем обесцвечивали 20% этанолом, содержащим 10% уксусной кислоты.Очищенные гели сканировали с использованием фотосканера Epson Perfection™ V700 Photo (Epson, China Co., Ltd.) с разрешением 800 точек на дюйм (dpi). Режим прозрачности использовался для получения изображения в градациях серого. Изображения были оцифрованы и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа PDQuest™ 2-DE 8.0 (BIO-RAD, Калифорния, США). Относительный объем каждого пятна, который определяется как отношение между объемом данного пятна и общим объемом всех пятен, отображаемых на геле, использовали для представления соответствующего содержания белка.Для получения воспроизводимого результата было проведено три биологических повторных эксперимента. Все 12 гелей были оцифрованы отдельно. Было проведено автоматическое сопоставление различных гелей с использованием четырех точек в качестве внутренних стандартов. После этого была проведена ручная регулировка во избежание рассогласования. Пятна, обнаруженные во всех трех повторностях, использовали для сравнительного анализа. Пятна, показывающие более чем 2-кратное изменение численности, были определены как дифференциально отображаемые белковые пятна.

Идентификация белков с помощью MALDI-TOF/TOF MS

Дифференциально отображаемые белковые пятна вырезали из гелей и окрашивали с использованием 50 мМ NH 4 HCO 3 в 50% (об./об.) ACN.После полного обесцвечивания вырезанные пятна сначала обезвоживали с использованием 50 мкл 100% ACN, а затем регидратировали с помощью 10 пмоль трипсина в 25 мМ NH 4 HCO 3 при 4°C в течение 1 часа. Расщепление трипсином проводили при 37°С в течение ночи. После расщепления пептиды экстрагировали в соответствии с описанным ранее методом (Yang et al., 2007). Собранные пептиды были обессолены и проанализированы на масс-спектрометре UltrafleXtreme Matrix-Assisted Laser Desorb/Ionization Tandem Time of Flight (MALDI-TOF/TOF) (Bruker, Германия) в режиме МС-МС.Все параметры были установлены по умолчанию. Вкратце, применялся лазер с частотой 0,5 кГц и разрешением 40 кГц. Программное обеспечение flexAnalysis (Bruker) использовалось для создания списков пиков и обработки спектров МС и МС/МС, поиск которых проводился по базам данных NCBInr (содержащей 15823071 последовательностей и 5433757279 остатков) и базам данных Swiss-Prot (содержащим 138011 последовательностей из B. napus). ) с использованием MASCOT в качестве поисковой системы (Mascot Wizard 1.2.0, Matrix Science Ltd.) через интерфейс BioTools (версия 3.2). Параметры поиска были заданы следующим образом: таксономия, Viridiplantae; фиксированные модификации, карбамидометилирование; переменная модификация, окисление метионина; допуск МС, 50 частей на миллион; Допуск МС/МС, 0.5 Да, масса пептида, моноизотоп. Принимались только значимые совпадения ( p <0,01) с оценкой пептида >45.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента t , когда сравнивались только две группы, или с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением критерия множественных сравнений Тьюки для всех остальных сравнений, основанных на трех независимых повторах.

Результаты

Определение подходящих процедур искусственного старения

Зрелые семена B.napus постепенно теряют жизнеспособность при длительном хранении, что определяется как естественное старение. Чтобы лучше понять процесс естественного старения, были рассчитаны проценты всхожести однолетних семян и свежесобранных семян. Свежесобранные семена начали прорастать сразу после 6 часов набухания, и для прорастания 50% семян потребовалось менее 12 часов (рис. 1). Напротив, прорастание старых семян явно задерживалось (рис. 1). Семенам годовалого возраста потребовалось около 30 ч для достижения 50% всхожести.Несмотря на задержку прорастания старых семян, большая часть семян все же смогла прорасти. Основываясь на этих результатах, мы пришли к выводу, что эти семена находились на ранней стадии естественного старения и, таким образом, могут использоваться в качестве критерия для определения подходящих методов искусственного старения.

Рисунок 1. Влияние искусственного старения на всхожесть семян Brassica napus . CK и NA – контрольные и натуральные состаренные семена (хранение 1 год).А 12, 24 и 48 ч – для семян, подвергнутых искусственному старению при температуре 40°С и относительной влажности 90% в течение 12, 24 и 48 ч соответственно.

Свежесобранные семена подвергали воздействию температуры 40°C и относительной влажности 90% в течение 0, 12, 24 и 48 часов, и жизнеспособность каждого образца семян проверяли с помощью анализов на всхожесть (рис. 1). Обработка, по-видимому, снижала скорость прорастания семян с увеличением времени воздействия (рис. 1). Для сравнения для дальнейшего исследования был выбран образец с аналогичной всхожестью с контролем естественного старения.На основании этого критерия 24-часовая обработка (рис. 1) была определена как подходящая обработка искусственным старением, так как ее скорость прорастания была почти такой же, как у семян естественного старения. В дальнейшем обработка при 40°C и относительной влажности 90% в течение 0 и 24 часов определяется как контрольная (CK) и обработка CDT, соответственно, в остальной части рукописи.

Влияние искусственного старения на физико-биохимический статус семян

B. napus

Как упоминалось выше, плазматическая мембрана может повреждаться при старении (Lee et al., 2012; Parkhey et al., 2012), поэтому для проверки целостности мембран измеряли относительную утечку ионов из образцов CK и CDT через 0 ч пропитки. Образцы CDT показали примерно в 1,8 раза более высокую утечку ионов, чем образцы CK, что указывает на большее повреждение мембраны в первом образце (рис. 2). Кроме того, измерения содержания MDA в семенах CK и CDT также показали повышенный уровень MDA в семенах CDT (рис. 2), что еще раз свидетельствует о повышенном повреждении мембран в семенах CDT.Помимо измерений утечки ионов и содержания МДА, мы также измерили концентрации H 2 O 2 и O , которые считаются двумя основными АФК в растениях. Неожиданно было обнаружено, что концентрации как H 2 O 2 , так и O в образцах CK и CDT одинаковы, что указывает на то, что повышение концентрации АФК может не быть необходимым событием во время старения семян B. napus . семена (рис. 3А). Постепенное снижение концентрации АФК наблюдалось при прорастании семян (рис. 3А).Однако снижение АФК в искусственно состаренных семенах было намного медленнее по сравнению с контрольным образцом (рис. 3А), что может объяснить задержку прорастания состаренных семян. В соответствии с изменениями концентрации АФК активность антиоксидантных ферментов, СОД и КАТ, также резко снизилась в семенах, подвергнутых искусственному старению перед прорастанием (рис. 3В).

Рисунок 2. Влияние CDT на утечку ионов и содержание МДА в семенах в 0 ч прорастания .Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка для трех биологических повторов. * и ** указывают на значимое различие при P < 0,05 и 0,01 соответственно.

Рисунок 3. Влияние CDT на гомеостаз АФК . (A) Содержание АФК, включая O (левая панель) и H 2 O 2 (правая панель). (B) Изменения активности СОД (левая панель) и КАТ (правая панель) во время прорастания. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка для трех биологических повторов.* и ** указывают на значимое различие при P < 0,05 и 0,01 соответственно.

Изменения в протеоме семян

B. napus , подвергнутых искусственному старению

Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе потери энергии семян из-за обработки искусственным старением; проведен сравнительный протеомный анализ. Основываясь на результатах анализа всхожести, семена CK и CDT показали очевидную разницу в скорости прорастания через 18 часов набухания (рис. 1), поэтому белки были выделены из B.napus через 0 и 18 ч после набухания соответственно. Затем белки будут разделены на 2-D PAGE и окрашены CBB R-250. Для каждого образца было выполнено три независимых повтора (рис. 4, S2). После окрашивания гели сканировали и оцифровывали для сравнения. Анализ гелей 2-DE проводили с помощью программного обеспечения PDQuest™ 2-DE Analysis (версия 8.0). Объединение биологических повторов показало, что на каждом геле было около 600 воспроизводимых белковых пятен (550–600). Сравнение гелей 2-ДЭ показало в общей сложности 81 дифференциально накопленное пятно (более чем двукратное изменение численности) между образцами CK и CDT, из которых 36 и 48 были от 0 до 18 ч имбибиции соответственно.В обе временные точки набухания обычны три пятна.

Рисунок 4. Репрезентативные двумерные гелевые изображения семян Brassica napus . Гели получены как из контрольных (левая панель), так и из обработанных (правая панель) семян через 0 и 18 ч после набухания. Стрелки показывают по-разному отображаемые белковые пятна, D и U обозначают белки с пониженной и повышающей регуляцией соответственно.

Чтобы узнать, участвуют ли какие-либо из этих дифференцированно накопленных пятен в процессе старения семян, их вырезали из гелей, расщепляли трипсином и подвергали анализу MALDI-TOF/TOF MS.На основании критериев, описанных в материалах и методах, было успешно идентифицировано 49 белковых пятен (дополнительная таблица S1). Среди них семь пятен были идентифицированы как два белка, что привело к идентификации в общей сложности 54 различных белков (таблица 1, рисунок S3). Из этих идентифицированных белков 15 белков имели только инвентарный номер B. napus EST. Последовательности этих белков были внесены в базу данных Arabidopsis, чтобы лучше понять их функции (таблица 2).Для многих идентифицированных белков наблюдались различия между их экспериментальным и теоретическим pI и молекулярной массой. Несколько возможностей могут помочь объяснить этот результат. Во-первых, геном B. napus не полностью секвенирован и аннотирован, что может привести к отклонениям; во-вторых, некоторые белки могут подвергаться посттрансляционным модификациям или расщеплению. Анализ онтологии MapMan (Thimm et al., 2004) отсортировал все идентифицированные белки по 10 функциональным группам, включая метаболизм, назначение белка, реакцию на стресс, окислительно-восстановительный гомеостаз, развитие, связанные с гормонами, клеточную структуру, различные ферменты, запасные белки и функциональные белки. (табл. 1, рис. 5).

Таблица 1. Идентификация дифференциально отображаемых белков в семенах рапса, подвергшихся искусственному старению .

Таблица 2. Взрыв идентифицированных белков путем поиска по Brassica napus базе данных EST .

Рисунок 5. Функциональные категории дифференциально отображаемых белков . Функциональная категоризация проводилась в соответствии с MapMan (Thimm et al., 2004).Цифровые числа обозначают количество белков в каждой группе.

Влияние АБК и ГА на старение семян

Поскольку никаких существенных различий в концентрациях АФК и активности антиоксидантных ферментов не наблюдалось после обработки CDT, мы предположили, что окислительный стресс не является основным фактором, участвующим в ингибировании прорастания после обработки CDT. Таким образом, можно было ожидать участие каких-то других факторов, которые привели к задержке прорастания после обработки CDT. Среди всех внешних и внутренних факторов АБК, по-видимому, является наиболее важным фактором, тормозящим прорастание семян.Поэтому мы измерили содержание АБК в семенах ЦК и CDT как через 0, так и через 18 ч после набухания. Интересно, что содержание АБК в семенах CDT было намного выше, чем в семенах CK в обе временные точки, и показало резкое снижение при впитывании в обоих образцах (рис. 6), что свидетельствует об участии АБК в старении семян. Для дальнейшего подтверждения этой гипотезы семена ЦК проращивали в присутствии АБК, и они показали задержку прорастания (рис. 7). Известно, что ГА и АБК играют антагонистические роли в регуляции прорастания семян, поэтому мы также проращивали семена CDT в присутствии ГА, чтобы увидеть, может ли эта обработка восстановить их фенотип прорастания или нет.Соответственно, семена CDT, обработанные GA, демонстрировали частично восстановленную всхожесть (рис. 7).

Рисунок 6. Содержание АБК в семенах Brassica napus , подвергшихся обработке CDT во время прорастания . Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка для трех биологических повторов. ** указывают на значимое различие при P < 0,01.

Рисунок 7. Влияние АБК и ГА на всхожесть семян Brassica napus . Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка для трех биологических повторов.

Обсуждение

Температура и влажность (относительная влажность) являются двумя важными факторами окружающей среды, влияющими на старение семян. Высокая температура и влажность ускоряют процесс старения семян, что приводит к быстрой потере их всхожести. Ускоренное старение применялось в качестве показателя сохраняемости семян сельскохозяйственных культур (Priestley, 1986). Чтобы изучить механизм старения семян, исследователи разработали протокол ускоренного старения в лаборатории, подвергая семена воздействию высокой температуры и влажности (Job, 2005; El-Maarouf-Bouteau et al., 2011). Предполагается, что АФК являются основными факторами, приводящими к старению семян при хранении (Bailly et al., 1996; Bailly, 2004; Kibinza et al., 2006; Parkhey et al., 2012). Чтобы понять механизмы, лежащие в основе старения семян B. napus , особенно на стадии инициации, мы подвергли семена B. napus CDT, что явно задержало прорастание и немного снизило скорость прорастания, которая была аналогична 1. год естественно созревшие семена (рис. 1).Эти результаты свидетельствуют о том, что эта обработка подходит для дальнейшего анализа, поскольку она может имитировать физиологию семян естественного возраста в течение 1 года.

CDT привел к повышенной утечке ионов (рис. 2), что отражает повреждение клеточных мембран. Это повреждение, в свою очередь, привело к накоплению МДА в семенах CDT (рис. 2). Ранее считалось, что атака АФК на мембраны может быть одной из причин, приводящих к утечке ионов (Leymarie et al., 2012). Кроме того, предыдущее исследование также показало, что высокая температура и влажность резко увеличивают степень окисления белка в семенах арабидопсиса (Rajjou et al., 2008). Однако после ЦДТ в семенах B. napus мы не обнаружили избыточного накопления АФК (рис. 3А) и дифференциально накопленных антиоксидантных ферментов, за исключением пероксиредоксина (табл. 1). Поскольку было обнаружено всего около 500 белков, нельзя было полностью исключить, что были изменены некоторые антиоксидантные ферменты. Несмотря на это, CDT действительно снижал скорость детоксикации АФК во время прорастания (рис. 3А), предполагая, что искусственное старение может нарушить систему удаления АФК.Этот результат также подтверждается снижением активности SOD и CAT (рис. 3B). CDT может снижать активность антиоксидантных ферментов из-за высокой температуры, поскольку большинство ферментов проявляют максимальную активность при температуре около 35°C в физиологических условиях.

Функциональная классификация идентифицированных белков показала, что белки, связанные с модификацией и назначением белков, развитием и клеточной структурой, по-разному модулировались после CDT. Однако предыдущие исследования гороха (Barba-Espin et al., 2011) и семенах пшеницы (Быкова и др., 2011) показали, что обработка H 2 O 2 предпочтительно регулирует белки, в основном участвующие в окислительно-восстановительном гомеостазе, метаболизме, гормонах и РНК, и может вызывать изменения белки со схожими функциями в разных тканях (Wan and Liu, 2008; Zhou et al., 2011). Различия в дифференцированно накопленных белках в этом исследовании с ранее опубликованными отчетами по гороху и пшенице позволяют предположить, что механизм старения семян у B.napus существенно отличается от показателей семян гороха и пшеницы. Наши результаты показывают, что обработка CDT может инициировать старение семян B. napus за счет усиления биосинтеза ингибиторов прорастания и, в последнее время, за счет накопления АФК. Несмотря на то, что между семенами CK и CDT был обнаружен 81 дифференцированный белок, только 49 пятен были успешно идентифицированы. Уровень идентификации составляет всего около 60%, что может быть объяснено несеквенированным геномом B.напус . Более того, семь пятен были идентифицированы как два разных белка, что должно затруднить оценку реального содержания каждого белка в них. Это одно из ограничений протеомных методов на основе двумерного геля. Будущие исследования безгелевых систем могут помочь предоставить больше информации.

Поскольку обработка CDT задерживает прорастание не в первую очередь из-за накопления АФК, мы предположили, что должны быть какие-то другие механизмы, которые опосредуют процесс старения семян у B.семена напус . Среди идентифицированных белков большая часть белков, участвующих в метаболизме и назначении белков, была снижена в семенах CDT. Эти результаты показывают, что основная биологическая активность может подавляться обработкой CDT, что приводит к задержке прорастания. Интересно, что большая субъединица rubisco увеличивалась в семенах, обработанных CDT, через 18 ч после прорастания, что указывает на наличие регуляции по принципу обратной связи. В отличие от белков, связанных с метаболизмом и назначением белка, многие клеточные структурные белки и различные ферменты, такие как актин, маннозо-связывающий белок суперсемейства лектинов, гликозилтрансфераза, бета-глюкозидаза, были повышены.Все эти белки связаны со структурами клетки и клеточной стенки. Было бы интересно узнать, как эти белки влияют на старение семян.

Сообщается, что среди всех внутренних факторов АБК является одним из основных факторов, подавляющих прорастание семян (Gubler et al., 2005; Finch-Savage and Leubner-Metzger, 2006; Penfield et al., 2006). Измерения содержания АБК в семенах B. napus показали резкое увеличение содержания АБК в семенах, обработанных CDT (рис. 6).Хотя АБК разлагалась во время проращивания, ее концентрация была все же выше в семенах, обработанных CDT, по сравнению с семенами, обработанными СК (рис. 6). Кроме того, пропитывание семян ЦК раствором АБК показало задержку прорастания (рис. 7). Прорастание семян, обработанных CDT, частично восстановилось после обработки GA, что еще раз подтверждает участие АБК в ингибировании прорастания семян при старении. Однако то, как эта концентрация АБК увеличивается во время обработки старением в B.napus , до сих пор неуловим. К сожалению, мы не обнаружили каких-либо изменений ферментов, участвующих в биосинтезе и деградации АБК. Хорошо известно, что АБК синтезируется в семенах во время высыхания, что позволяет семенам выживать в сухом состоянии (Tan et al., 1997; Nakabayashi et al., 2005). В ходе этого процесса была обнаружена высокая экспрессия генов, участвующих в биосинтезе АБК, и обильное накопление соответствующих ферментов. Основываясь на этих результатах, мы предполагаем, что воздействие на семена высокой влажности и температуры может частично восстановить активность ферментов биосинтеза АБК, что приводит к увеличению продукции АБК в B.napus в процессе старения.

Вклад авторов

YX проводил эксперименты; HD подготовил семена и проанализировал некоторые данные; YP разработал эксперименты и написал рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность г-же Тинтин Ли из Института гидробиологии Китайской академии наук за помощь в анализе MALDI-TOF/TOF MS.Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC, № 31271805), программой 100 талантов Китайской академии наук и китайско-африканским совместным исследовательским проектом (SAJC201324).

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: http://www.frontiersin.org/journal/10.3389/fpls.2015.00112/abstract

.

Таблица S1. Идентификация дифференциально экспрессируемых белков .

Ссылки

Байи, К.(2004). Активные формы кислорода и антиоксиданты в биологии семян. Науки о семенах. Рез . 14, 93–107. дои: 10.1079/SSR2004159

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Байи К., Бенамар А., Корбино Ф. и Коме Д. (1996). Изменения содержания малонового диальдегида и активности супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионредуктазы в семенах подсолнечника в связи с ухудшением состояния при ускоренном старении. Физиол. Завод . 97, 104–110. doi: 10.1111/j.1399-3054.1996.tb00485.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Барба-Эспин Г., Диас-Виванкос П., Джоб Д., Белгази М., Джоб К. и Эрнандес Дж. А. (2011). Понимание роли H (2) O (2) во время прорастания семян гороха: комбинированный подход к протеомному и гормональному профилированию. Окружающая среда растительных клеток . 34, 1907–1919. doi: 10.1111/j.1365-3040.2011.02386.x

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Быкова Н.В., Hoehn, B., Rampitsch, C., Banks, T., Stebbing, J.A., Fan, T., et al. (2011). Стратегии редокс-чувствительного протеома и антиоксидантов в контроле покоя семян пшеницы. Протеомика 11, 865–882. doi: 10.1002/pmic.200

0

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Chatelain, E., Satour, P., Laugier, E., Ly Vu, B., Payet, N., Rey, P., et al. (2013). Доказательства участия системы репарации метионинсульфоксидредуктазы в долговечности семян растений. Проц. Натл. акад. науч. США . 110, 3633–3638. doi: 10.1073/pnas.1220589110

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Chen, M.L., Fu, X.M., Liu, J.Q., Ye, T.T., Hou, S.Y., Huang, Y.Q., et al. (2012). Высокочувствительное и количественное профилирование кислых фитогормонов с использованием подхода дериватизации в сочетании с анализом нано-ЖХ-ESI-Q-TOF-MS. Ж. Хроматогр. Б 905, 67–74. doi: 10.1016/j.jchromb.2012.08.005

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чи, Ф., Ян П., Хань Ф., Цзин Ю. и Шен С. (2010). Протеомный анализ проростков риса, инфицированных Sinorhizobium meliloti 1021. Протеомика 10, 1861–1874. doi: 10.1002/pmic.200

4

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Clerkx, E.J., El-Lithy, M.E., Vierling, E., Ruys, G.J., Blankestijn-De Vries, H., Groot, S.P., et al. (2004). Анализ естественной аллельной изменчивости признаков всхожести и долговечности семян арабидопсиса между образцами Landsberg erecta и Shakdara с использованием популяции новой рекомбинантной инбредной линии. Завод Физиол . 135, 432–443. doi: 10.1104/стр.103.036814

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Корбино, Ф., Гей-Матье, К., Винель, Д., и Ком, Д. (2002). Снижение жизнеспособности семян подсолнечника ( Helianthus annuus ), вызванное высокой температурой, в связи с энергетическим обменом, повреждением мембран и липидным составом. Физиол. Завод . 116, 489–496. doi: 10.1034/j.1399-3054.2002.1160407.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Эллис, Р.(1992). Энергия семян и рассады в зависимости от роста и урожайности культур. Регулятор роста растений . 11, 249–255. дои: 10.1007/BF00024563

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Гарса-Калигарис, Л. Э., Авендано-Васкес, А. О., Альварадо-Лопес, С., Зунига-Санчес, Э., Ороско-Сеговия, А., Перес-Руис, Р. В., и другие. (2012). Транскрипт At3g08030: молекулярный маркер старения семян. Энн. Бот . 110, 1253–1260. doi: 10.1093/aob/mcs200

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Он, Д., Хан, К., и Ян, П. (2011). Изменения профиля экспрессии генов в прорастающем рисе. Дж. Интегр. Растение Биол . 53, 835–844. doi: 10.1111/j.1744-7909.2011.01074.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Jaw-Neng Lin, CHK (1998). Влияние окислительного стресса, вызванного перекисью водорода, на старение листьев риса. Бот. Бык. акад. Грех . 39, 161–165.

Академия Google

Кибинза, С., Винель, Д., Ком, Д., Байи, К., и Корбино, Ф.(2006). Ухудшение качества семян подсолнечника в зависимости от содержания влаги в процессе старения, энергетического обмена и поглощения активных форм кислорода. Завод Физиол . 128, 496–506. doi: 10.1111/j.1399-3054.2006.00771.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ли, Дж., Велти, Р., Рот, М., Шапо, В.Т., Ли, Дж., и Трик, Х.Н. (2012). Повышение жизнеспособности семян и изменение состава липидов при естественном старении за счет подавления фосфолипазы D-альфа в семенах сои. Завод Биотехнолог.Дж . 10, 164–173. doi: 10.1111/j.1467-7652.2011.00650.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Леймари Дж., Виткаускайте Г., Хоанг Х.Х., Жендро Э., Шазул В., Меймун П. и соавт. (2012). Роль активных форм кислорода в регуляции покоя семян арабидопсиса. Физиол растительных клеток . 53, 96–106. doi: 10.1093/pcp/pcr129

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Накабаяши К., Окамото М., Косиба Т., Камия Ю. и Намбара Э. (2005). Полногеномное профилирование хранимой мРНК в прорастании семян Arabidopsis thaliana : эпигенетическая и генетическая регуляция транскрипции в семенах. Завод J . 41, 697–709. doi: 10.1111/j.1365-313X.2005.02337.x

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Oge, L., Bourdais, G., Bove, J., Collet, B., Godin, B., Granier, F., et al. (2008). Репарация белка L-изоаспартилметилтрансфераза 1 участвует как в долговечности семян, так и в силе прорастания арабидопсиса. Растительная клетка 20, 3022–3037. doi: 10.1105/tpc.108.058479

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пенфилд, С., Ли, Ю., Гилдей, А.Д., Грэм, С., и Грэм, И.А. (2006). Arabidopsis, ABA INSENSITIVE4, регулирует мобилизацию липидов в зародыше и выявляет подавление прорастания семян эндоспермом. Растительная клетка 18, 1887–1899. doi: 10.1105/tpc.106.041277

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пристли, Д.А. (1986). Старение семян: последствия для хранения и устойчивости семян в почве . Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Издательство Корнельского университета.

Академия Google

Раджоу, Л., Дюваль, М., Галлардо, К., Катус, Дж., Балли, Дж., Иов, К., и др. (2012). Всхожесть и энергия семян. Год. Rev. Растение Биол . 63, 507–533. doi: 10.1146/annurev-arplant-042811-105550

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Раджоу, Л., Ловиньи, Ю., Грут, С.П.К., Бельгази, М., Джоб, К. и Джоб, Д. (2008). Протеомная характеристика старения семян арабидопсиса: сравнение протоколов искусственного и естественного старения. Завод Физиол . 148, 620–641. doi: 10.1104/стр.108.123141

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Саттлер, С.Э., Гиллиленд, Л.У., Магалланес-Лундбак, М., Поллард, М., и ДеллаПенна, Д. (2004). Витамин Е необходим для долговечности семян и предотвращения перекисного окисления липидов во время прорастания. Растительная клетка 16, 1419–1432. doi: 10.1105/tpc.021360

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Thimm, O., Blsing, O., Gibon, Y., Nagel, A., Meyer, S., Krüger, P., et al. (2004). MAPMAN: управляемый пользователем инструмент для отображения наборов геномных данных на диаграммах метаболических путей и других биологических процессов. Завод J . 37, 914–939. doi: 10.1111/j.1365-313X.2004.02016.x

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Верма, П., Каур, Х., Петла, Б.П., Рао, В., Саксена, С.К., и Маджи, М. (2013). БЕЛОК L-ИЗОАСПАРТИЛМЕТИЛТРАНСФЕРАЗА 2 по-разному экспрессируется в нуте и повышает силу и продолжительность жизни семян за счет снижения аномального накопления изоаспартила преимущественно в ядерных белках семян. Завод Физиол . 161, 1141–1157. doi: 10.1104/стр.112.206243

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Уолтерс, К., Уилер, Л.М., и Гротенхейс, Дж.М. (2005). Долговечность семян, хранящихся в генбанке: видовая характеристика. Науки о семенах. Рез . 15, 1–20. дои: 10.1079/SSR2004195

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ян П., Ли Х., Ван Х., Чен Х., Чен Ф. и Шен С. (2007). Протеомный анализ семян риса (Oryza sativa) при проращивании. Протеомика 7, 3358–3368. doi: 10.1002/pmic.200700207

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Физиологический и протеомный анализ искусственно состаренных семян Brassica napus

Front Plant Sci.2015 г.; 6: 112.

Xiaojian Yin

1 Ключевая лаборатория по улучшению зародышевой плазмы растений и специальному сельскому хозяйству, Ботанический сад Ухани, Китайская академия наук, Ухань, Китай

Dongli He

1 и специализированное сельское хозяйство, Уханьский ботанический сад, Китайская академия наук, Ухань, Китай

Рави Гупта

2 Кафедра биологии растений, Колледж природных ресурсов и наук о жизни, Пусанский национальный университет, Мирьянг, Южная Корея

Пингфан Ян

1 Ключевая лаборатория улучшения зародышевой плазмы растений и специального земледелия, Уханьский ботанический сад, Китайская академия наук, Ухань, Китай , Ухань, Китай

2 Кафедра биологии растений, Колледж Кандидат природных ресурсов и биологических наук, Пусанский национальный университет, Мирьянг, Южная Корея

Под редакцией: Ганеша Кумара Агравала, Исследовательская лаборатория биотехнологии и биохимии, Непал

Рецензент: Джошуа Л.Хизлвуд, Мельбурнский университет, Австралия; Аркадиуш Космала, Институт генетики растений Польской академии наук, Польша

. был представлен в Plant Proteomics, раздел журнала Frontiers in Plant Science.

Поступила в редакцию 11 сентября 2014 г .; Принято 11 февраля 2015 г.

Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (CC BY).Использование, распространение или воспроизведение на других форумах разрешено при условии указания автора(ов) или лицензиара оригинала и ссылки на оригинальную публикацию в этом журнале в соответствии с общепринятой академической практикой. Запрещается использование, распространение или воспроизведение без соблюдения этих условий.

Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.
Дополнительные материалы

Таблица S1: Идентификация дифференциально экспрессируемых белков .

GUID: 2DA0940C-06FA-4ED2-80A6-2D0654721D80

GUID: 4833258C-7592-4C3E-95B7-52F580738156

GUID: C069447E-9AC3-4686-8EA1-6741D8500340

GUID: 9E198B88-7FE1-4B22-B859 -47EDF8385DF1

Abstract

Семена растений теряют свою жизнеспособность при длительном хранении или обработке с контролируемой порчей в результате процесса, известного как старение семян. На основе предыдущих исследований были разработаны методы искусственного старения, чтобы ускорить процесс старения семян, чтобы понять его основные механизмы.В этом исследовании мы использовали семян Brassica napus для изучения механизмов инициации старения. Семена B. napus подвергали искусственному старению (40°С, относительная влажность 90%) и анализировали их физико-биохимические характеристики. Хотя обработка задерживала прорастание, она не увеличивала концентрацию клеточных активных форм кислорода (АФК). Проведен сравнительный протеомный анализ контрольных и обработанных семян на разных стадиях прорастания.Белки, реагирующие на лечение, в основном участвовали в метаболизме, модификации и назначении белков, реакции на стресс, развитии и различных ферментах. За исключением пероксиредоксина, в искусственно состаренных семенах изменений в накоплении других антиоксидантных ферментов не наблюдалось. В искусственно обработанных семенах наблюдалось повышенное содержание абсцизовой кислоты (АБК), что могло быть связано с ингибированием прорастания. В совокупности наши результаты подчеркивают участие АБК в инициировании старения семян в дополнение к АФК, о которых ранее сообщалось, что они опосредуют процесс старения семян.

Ключевые слова: Brassica napus , старение семян, обработка с контролируемым ухудшением состояния, протеомика силу семян (Holdsworth et al., 2008; Rajjou et al., 2012). Старение семян — это процесс, который приводит к задержке прорастания, снижению скорости прорастания, а иногда даже к полной потере жизнеспособности семян (Priestley, 1986).Длительное хранение семян вызывает их старение, что является серьезной проблемой при сохранении зародышевой плазмы растений (Garza-Caligaris et al., 2012). В сельском хозяйстве вызревшие семена сельскохозяйственных культур плохо прорастают и отрицательно сказываются на росте всходов и, в конечном итоге, на урожайности (Ellis, 1992). При хранении в неконтролируемых условиях большинство сельскохозяйственных культур имеют всхожесть семян от 1 до 5 лет, что значительно меньше по сравнению с дикорастущими растениями. Доказано, что оптимизированные условия хранения способствуют замедлению скорости старения семян и, в конечном итоге, увеличению продолжительности жизни семян.Для ортодоксальных семян полезна низкая температура и влажность (Walters et al., 2005), тогда как высокая температура и влажность вызывают и ускоряют процесс старения семян (El-Maarouf-Bouteau et al., 2011).

Старение семян приводит к различным клеточным и метаболическим изменениям, включая потерю целостности мембран, деградацию ДНК, снижение первичного метаболизма и т. д. (Corbineau et al., 2002; Kibinza et al., 2006; El-Maarouf-Bouteau et al. , 2011). Хотя зрелые семена находятся в состоянии физиологического покоя, они не могут предотвратить образование активных форм кислорода (АФК).Предполагается, что избыточное накопление АФК и их воздействие на липиды и белки являются основной причиной старения семян (Bailly, 2004). АФК приводят к перекисному окислению и деградации липидов, что в конечном итоге нарушает целостность клеточных мембран (Lee et al., 2012; Parkhey et al., 2012). Обычно АФК рассматриваются как основной фактор, приводящий к старению семян при хранении (Priestley, 1986). Было показано, что накопление перекиси водорода связано с потерей жизнеспособности семян подсолнечника (Bailly et al., 1996; Кибинза и др., 2006). В условиях стресса АФК способствуют программной гибели клеток (ПКС) как у растений, так и у животных (Grant and Loake, 2000; Neill et al., 2002). Однако до сих пор неизвестно, индуцируется ли старение семян также АФК через запуск ПКС или нет.

Старение семян тесно связано с условиями хранения, однако недавние исследования показали, что семена разных видов растений демонстрируют разную скорость старения семян при одних и тех же условиях хранения (Walters et al., 2005). Считается, что жизнеспособность семян определяется их генетическим фоном, а также условиями хранения (Bewley, 1997; Miura et al., 2002; Clerkx et al., 2004). У Arabidopsis гены, участвующие в биосинтезе флавоноидов и токоферолов, могут способствовать долговечности семян (Debeaujon et al., 2000; Sattler et al., 2004). Кроме того, связанный с покоем ген задерживал прорастание 1 ( DOG1 ) (Bentsink et al., 2006) и фактор транскрипции, чувствительный к тепловому стрессу (Prieto-Dapena et al., 2006) также улучшают устойчивость к старению. Недавние исследования подтвердили, что метионинсульфоксидредуктазы из Medicago truncatula и протеин L-изоаспартилметилтрансфераза (PIMT) из арабидопсиса и лотоса ( Nelumbo nucifera ) могут повышать силу и долговечность семян (Oge et al., 2008; Chatelain et al. ., 2013; Верма и др., 2013). С развитием геномики и других крупномасштабных методов «омики» за последнее десятилетие был проведен ряд транскриптомных и протеомных исследований с целью выявления и характеристики потенциальных биомаркеров старения семян (Nakabayashi et al., 2005; Раджоу и др., 2008).

Brassica napus является одним из основных источников пищевого масла во всем мире. Однако семян B. napus заготавливают поздней весной, а их хранение переходят на летний период, что приводит к потере их всхожести. Таким образом, имеет большое практическое значение предотвращение потери энергии семян, для чего необходимо получить всестороннее представление о механизмах, лежащих в основе старения семян. К сожалению, исследование на эту тему в B.napus довольно слабый. В этом исследовании мы подвергли семена B. napus воздействию высокой температуры и влажности и провели сравнительный протеомный анализ контрольных и искусственно состаренных семян, чтобы понять лежащие в их основе механизмы. Было идентифицировано много дифференциально накапливаемых белков, которые отличались от предыдущих исследований на других растениях. Наши результаты дают новое представление о механизмах старения семян у B. napus .

Материалы и методы

Рост растений, обработка старением и анализ прорастания

B.napus (zhongshuang11) выращивали в теплице в условиях естественного освещения в Ухане, Китай. Семена, не находящиеся в состоянии покоя, собирали в мае каждого года и использовали в качестве экспериментального материала. Свежесобранные семян B. napus обрабатывали высокой температурой и влажностью в соответствии с Rajjou et al. (2008) с небольшими изменениями. Вкратце, семена подвергали воздействию температуры 40°С и влажности воздуха 90% в разные моменты времени (0, 12, 24 и 48 ч). Семена, хранившиеся при комнатной температуре в герметичном полиэтиленовом пакете, в сухих условиях в течение 1 года, использовали как семена естественного созревания.

Необработанные и обработанные семена сушили в духовке при 40°C в течение ночи, а затем погружали в дистиллированную воду при 26°C в темноте для прорастания. Всхожесть для каждого образца рассчитывали через каждые 6 ч до прекращения прорастания семян. Для экспериментов по обработке абсцизовой кислотой (АБК) и извлечению гибберелловой кислоты (ГК) семена пропитывали растворами 10 -8 М АБК и 10 -7 М GA 3 во время прорастания соответственно. Для каждой обработки выполняли три биологические повторности, а также анализ всхожести с 50 семенами в каждом наборе повторности.Схематическая блок-схема всего эксперимента показана на рисунке S1.

Измерение утечки ионов, содержания малонового диальдегида и перекиси водорода

Утечку ионов рассчитывали, как описано ранее (Shi et al., 2012), путем измерения относительной проводимости образцов. Вкратце, 0,1 г семян обоих образцов при 0 ч прорастания инкубировали в 6 мл дистиллированной воды в течение 4 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. После инкубации измеряли начальную проводимость (C1) раствора.Конечную электропроводность (С2) раствора измеряли после кипячения семян в течение 30 мин и охлаждения раствора до комнатной температуры. REL рассчитывали как процент электропроводности до и после кипячения [(C1/C2) × 100] с использованием измерителя электропроводности (Leici-DDS-307A, Shanghai Precision Scientific Instrument Company, Шанхай, Китай).

Содержание малонового диальдегида (МДА) измеряли с использованием коммерческого набора (S0131, Beyotime, Нанкин, Китай) в соответствии с протоколом производителя, который основан на реакции между МДА и тиобарбитуровой кислотой с образованием соединения красного цвета.Вкратце, 0,2 г семян гомогенизировали с 2 мл охлажденного льдом фосфатного буфера и центрифугировали при 1600 × г в течение 10 мин при 4°C. Затем надосадочную жидкость смешивали с равным объемом 0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты. Смесь кипятили 10 мин. После охлаждения водой до комнатной температуры смесь центрифугировали при 3000× g в течение 15 мин при комнатной температуре. Поглощение супернатанта определяли при 530 нм. Концентрацию МДА рассчитывали по стандартной кривой, построенной с использованием известных концентраций МДА.

Измерение H 2 O 2 проводилось в соответствии с методом, описанным ранее (Jaw-Neng Lin, 1998). Вкратце, 0,1 г семян гомогенизировали в буфере PBS и центрифугировали при 12000 × г в течение 20 мин при 4°C. Супернатант смешивали с равным объемом 0,1% сульфата титана в 20% H 2 SO 4 (об./об.) и снова центрифугировали при 6000 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Поглощение супернатанта измеряли при 410 нм.Концентрацию H 2 O 2 рассчитывали на основании стандартной кривой, построенной для ряда растворов H 2 O 2 с известной концентрацией. Все измерения проводились в трех биологических повторностях.

Измерение содержания абсцизовой кислоты

Концентрацию АБК измеряли с использованием метода дериватизации в сочетании с нано-ЖХ-ESI-Q-TOF-MS (Bruker Daltonics, Бремен, Германия), как описано ранее (Chen et al., 2012).Вкратце, 0,1 мг семян гомогенизировали в жидком азоте, а затем переносили порошок в центрифужную пробирку на 2 мл с последующей экстракцией 500 мкл модифицированного растворителя Биелески (метанол/вода/муравьиная кислота, 15/4/1, объем/объем). /v) добавляли к нему и смесь инкубировали при 4°C в течение 12 часов. Стабильный изотоп, помеченный АБК ([ 2 H 6 ] АБК, 50 нг/г), добавляли к каждому из образцов, чтобы они служили внутренними стандартами для количественного определения. Затем супернатанты последовательно пропускали через картриджи тандемной твердофазной экстракции (ТФЭ), содержащие адсорбент С18 (50 мг) и адсорбент ПАХ (200 мг).Перед экстракцией ТФЭ тандемные картриджи предварительно кондиционировали 8 мл H 2 O, 8 мл метанола и 8 мл модифицированного растворителя Биелески. После загрузки образца картридж C18 удаляли, а картридж SAX промывали 2 мл метанола/H 2 O (20/80, об./об.). После этого для элюирования целевой АБК применяли 3 мл ацетонитрила (CAN) с 1% плавиковой кислотой (FA) (об./об.), элюент выпаривали в токе слабого азота при 35°C с последующим повторным растворением в 100 мкл. Н 2 О.Полученный раствор (100 мкл) затем подкисляли 10 мкл ФК и экстрагировали эфиром (2 х 1 мл). Эфирную фазу объединяли, сушили в атмосфере азота и восстанавливали в 100 мкл ACN. К полученному раствору добавляли 10 мкл триэтиламина (ТЭА) (20 мкмоль/мл) и 10 мкл 3-бромактонилтриметиламмония бромида (БТА) (20 мкмоль/мл). Реакционный раствор встряхивали в течение 30 мин при 35°C и выпаривали в атмосфере азота с последующим повторным растворением в 200 мкл H 2 O/ACN (90/10, об./об.) для инструментального анализа.Калибровочную кривую строили путем сравнения соотношения площадей пиков (аналит/IS) с концентрациями. Содержание АБК рассчитывали по калибровочной кривой. Было проведено три биологических повтора.

Анализ активности супероксиддисмутазы и каталазы

Общую активность супероксиддисмутазы (СОД) измеряли с использованием коммерческого набора WST-1 (S0102, Beyotime) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, семена измельчали ​​с использованием жидкого азота, а затем гомогенизировали в фосфатно-сбалансированном растворе-буфере (PBS, pH 7.5). Смесь центрифугировали при 12 000 × g при 4°С в течение 15 мин. Полученный таким образом супернатант использовали для измерения активности СОД. Принцип этого метода заключался в сочетании 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,16-4-дисульфофенил)-2H-тетразолия (WST-1) с ксантиноксидазой (XO ) для получения O 2- и формазанового красителя, который может быть ингибирован SOD путем катализа O 2- в H 2 O 2 и O 2 . Активность СОД можно рассчитать, определив оптическую плотность формазанового красителя при 450 нм.

Активность каталазы (CAT) анализировали с использованием коммерческого набора (S0051, Beyotime), как описано ранее (Shi et al., 2012). Вкратце, 10 мкл 250 мМ H 2 O 2 смешивали с 5 мкл белкового супернатанта. H 2 O 2 разлагали с помощью CAT в течение 5 мин, а оставшийся H 2 O 2 , связанный с субстратом, обрабатывали пероксидазой (POD) с образованием N-4-антипирил-3-хлор. -5-сульфонат-п-бензохинонмоноимин. Активность CAT определяли путем расчета скорости разложения H 2 O 2 при 520 нм.Оба фермента анализировали в трех повторностях.

Экстракция белков и двумерный электрофорез

Белки экстрагировали из семян B. napus через 0 и 18 ч после набухания по методу, описанному ранее (Chi et al., 2010). Вкратце, 0,2 г семян гомогенизировали в ледяном буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl (рН 7,5), 250 мМ сахарозы, 10 мМ этиленбис(оксиэтиленнитрило)тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1 мМ фенилметансульфонилфторида (ФМСФ), 1 мМ DL-дитиотреитол (DTT) и 1% Triton X-100.Гомогенат центрифугировали при 12000× g в течение 30 мин при 4°С. Супернатант смешивали с изометрическим трис-фенолом (рН 7,8) и встряхивали в течение 20 мин. Затем смесь центрифугировали при 12000 × g в течение 15 мин при 4°С. После центрифугирования собирали надосадочную фенольную фазу и промежуточный слой денатурированного белка. Затем фенольную фазу, содержащую белки, смешивали с 5 объемами 0,1 М ацетата аммония в метаноле и инкубировали при -20°С в течение ночи. Осадок, полученный после центрифугирования при 12000× g в течение 30 мин, промывали 4 раза ледяным ацетоном и сушили в вакууме.Для двумерного электрофореза (2-DE) высушенные осадки белков растворяли в регидратационном буфере, содержащем 7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]пропансульфоната (CHAPS), 0,2% носителя амфолита. и 65 мМ ДТТ, и количественно определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976; Kruger, 1994). В общей сложности 600 мкг белков каждого образца наносили на 17-см полоску IPG путем регидратации в течение 12 ч при комнатной температуре. На основании первичного скрининга в данном исследовании были отобраны полоски ИФЗ с рН 5–8 (линейный).Изоэлектрофокусировку (ИЭФ) проводили при 200, 500 и 8000 В в течение 1, 1,5 и 10,5 ч соответственно (He et al., 2011). После ИЭФ полоски инкубировали в уравновешивающем буфере, содержащем 0,05 М Трис-HCl pH 6,8, 2,5% ДСН, 10% (об/об) глицерина и 2% ДТТ, и встряхивали в течение 15 мин, а затем еще 15 мин с йодацетамидом. заменен уравновешивающий буфер DTT. Двухмерное разделение белков проводили на 12% SDS-PAGE (Li et al., 2012).

Окрашивание геля, сканирование и анализ

Гели окрашивали кумасси бриллиантовым сине-красным (CBB-R) 250 в течение 40 мин, а затем обесцвечивали 20% этанолом, содержащим 10% уксусной кислоты.Очищенные гели сканировали с использованием фотосканера Epson Perfection™ V700 Photo (Epson, China Co., Ltd.) с разрешением 800 точек на дюйм (dpi). Режим прозрачности использовался для получения изображения в градациях серого. Изображения были оцифрованы и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа PDQuest™ 2-DE 8.0 (BIO-RAD, Калифорния, США). Относительный объем каждого пятна, который определяется как отношение между объемом данного пятна и общим объемом всех пятен, отображаемых на геле, использовали для представления соответствующего содержания белка.Для получения воспроизводимого результата было проведено три биологических повторных эксперимента. Все 12 гелей были оцифрованы отдельно. Было проведено автоматическое сопоставление различных гелей с использованием четырех точек в качестве внутренних стандартов. После этого была проведена ручная регулировка во избежание рассогласования. Пятна, обнаруженные во всех трех повторностях, использовали для сравнительного анализа. Пятна, показывающие более чем 2-кратное изменение численности, были определены как дифференциально отображаемые белковые пятна.

Идентификация белков с помощью MALDI-TOF/TOF MS

Дифференциально отображаемые белковые пятна вырезали из гелей и окрашивали с использованием 50 мМ NH 4 HCO 3 в 50% (об./об.) ACN.После полного обесцвечивания вырезанные пятна сначала обезвоживали с использованием 50 мкл 100% ACN, а затем регидратировали с помощью 10 пмоль трипсина в 25 мМ NH 4 HCO 3 при 4°C в течение 1 часа. Расщепление трипсином проводили при 37°С в течение ночи. После расщепления пептиды экстрагировали в соответствии с описанным ранее методом (Yang et al., 2007). Собранные пептиды были обессолены и проанализированы на масс-спектрометре UltrafleXtreme Matrix-Assisted Laser Desorb/Ionization Tandem Time of Flight (MALDI-TOF/TOF) (Bruker, Германия) в режиме МС-МС.Все параметры были установлены по умолчанию. Вкратце, применялся лазер с частотой 0,5 кГц и разрешением 40 кГц. Программное обеспечение flexAnalysis (Bruker) использовалось для создания списков пиков и обработки спектров МС и МС/МС, поиск которых проводился по базам данных NCBInr (содержащей 15823071 последовательностей и 5433757279 остатков) и базам данных Swiss-Prot (содержащим 138011 последовательностей из B. napus). ) с использованием MASCOT в качестве поисковой системы (Mascot Wizard 1.2.0, Matrix Science Ltd.) через интерфейс BioTools (версия 3.2). Параметры поиска были заданы следующим образом: таксономия, Viridiplantae; фиксированные модификации, карбамидометилирование; переменная модификация, окисление метионина; допуск МС, 50 частей на миллион; Допуск МС/МС, 0.5 Да, масса пептида, моноизотоп. Принимались только значимые совпадения ( p <0,01) с оценкой пептидов >45.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента t , когда сравнивались только две группы, или однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Тьюки для всех остальных сравнений, основанных на трех независимых повторах.

Результаты

Определение подходящих методов искусственного старения

Зрелые семена B.napus постепенно теряют жизнеспособность при длительном хранении, которое определяется как естественное старение. Чтобы лучше понять процесс естественного старения, были рассчитаны проценты всхожести однолетних семян и свежесобранных семян. Свежесобранные семена начали прорастать сразу после 6 часов набухания, и для прорастания 50% семян потребовалось менее 12 часов (рис. ). Напротив, прорастание старых семян явно задерживалось (рис. ). Семенам годовалого возраста потребовалось около 30 ч для достижения 50% всхожести.Несмотря на задержку прорастания старых семян, большая часть семян все же смогла прорасти. Основываясь на этих результатах, мы пришли к выводу, что эти семена находились на ранней стадии естественного старения и, таким образом, могут использоваться в качестве критерия для определения подходящих методов искусственного старения.

Влияние процедур искусственного старения на всхожесть семян Brassica napus . CK и NA – контрольные и натуральные состаренные семена (хранение 1 год). А 12, 24 и 48 ч – для семян, подвергнутых искусственному старению при температуре 40°С и относительной влажности 90% в течение 12, 24 и 48 ч соответственно.

Свежесобранные семена подвергали воздействию температуры 40°C и относительной влажности 90% в течение 0, 12, 24 и 48 часов, и жизнеспособность каждого образца семян проверяли с помощью анализов на всхожесть (рис. ). Обработка, по-видимому, снижала скорость прорастания семян с увеличением времени воздействия (рис. ). Для сравнения для дальнейшего исследования был выбран образец с аналогичной всхожестью с контролем естественного старения. На основании этого критерия 24-часовая обработка (рисунок ) была определена как подходящая обработка искусственным старением, так как ее скорость прорастания была почти такой же, как у семян естественного старения.В дальнейшем обработка при 40°C и относительной влажности 90% в течение 0 и 24 часов определяется как контрольная (CK) и обработка CDT, соответственно, в остальной части рукописи.

Влияние искусственного старения на физико-биохимический статус семян

B. napus

Как упоминалось выше, плазматическая мембрана может повреждаться при старении (Lee et al., 2012; Parkhey et al., 2012), поэтому в Для проверки целостности мембран измеряли относительную ионную утечку образцов CK и CDT через 0 ч пропитки.Образцы CDT показали примерно в 1,8 раза более высокую утечку ионов, чем образцы CK, что указывает на большее повреждение мембраны в первом образце (рис. ). Кроме того, измерения содержания MDA в семенах CK и CDT также показали повышенный уровень MDA в семенах CDT (рис. ), что еще раз свидетельствует о повышенном повреждении мембран в семенах CDT. Помимо измерений утечки ионов и содержания МДА, мы также измерили концентрации H 2 O 2 и O , которые считаются двумя основными АФК в растениях.Неожиданно было обнаружено, что концентрации как H 2 O 2 , так и O в образцах CK и CDT одинаковы, что указывает на то, что повышение концентрации АФК может не быть необходимым событием во время старения семян B. napus . семена (рис. ). Постепенное снижение концентрации АФК наблюдалось при прорастании семян (рис. ). Однако снижение АФК в искусственно состаренных семенах происходило гораздо медленнее по сравнению с контрольным образцом (рис. ), что может объяснить задержку прорастания состаренных семян.В соответствии с изменениями концентрации АФК активность антиоксидантных ферментов, СОД и КАТ, также резко снизилась в семенах, подвергнутых искусственному старению перед прорастанием (рис. 1).

Влияние ЦДТ на утечку ионов и содержание МДА в семенах в 0 ч прорастания . Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка для трех биологических повторов. * и ** указывают на значимое различие при P < 0,05 и 0,01 соответственно.

Влияние CDT на гомеостаз АФК . (A) Содержание АФК, включая O (левая панель) и H 2 O 2 (правая панель). (B) Изменения активности СОД (левая панель) и КАТ (правая панель) во время прорастания. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка для трех биологических повторов. * и ** указывают на значимое различие при P < 0,05 и 0,01 соответственно.

Изменения в протеоме

B.napus семена, подвергнутые искусственному старению

Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе потери жизнеспособности семян из-за искусственного старения; проведен сравнительный протеомный анализ. Основываясь на результатах анализа всхожести, семена CK и CDT показали очевидную разницу в скорости прорастания через 18 часов набухания (рис. ), поэтому белки были выделены из семян B. napus через 0 и 18 часов после набухания соответственно. Затем белки будут разделены на 2-D PAGE и окрашены CBB R-250.Для каждого образца было выполнено три независимых повтора (рис. , S2). После окрашивания гели сканировали и оцифровывали для сравнения. Анализ гелей 2-DE проводили с помощью программного обеспечения PDQuest™ 2-DE Analysis (версия 8.0). Объединение биологических повторов показало, что на каждом геле было около 600 воспроизводимых белковых пятен (550–600). Сравнение гелей 2-ДЭ показало в общей сложности 81 дифференциально накопленное пятно (более чем двукратное изменение численности) между образцами CK и CDT, из которых 36 и 48 были от 0 до 18 ч имбибиции соответственно.В обе временные точки набухания обычны три пятна.

Репрезентативные двумерные гелевые изображения семян Brassica napus . Гели получены как из контрольных (левая панель), так и из обработанных (правая панель) семян через 0 и 18 ч после набухания. Стрелки показывают по-разному отображаемые белковые пятна, D и U обозначают белки с пониженной и повышающей регуляцией соответственно.

Чтобы узнать, участвуют ли какие-либо из этих дифференцированно накопленных пятен в процессе старения семян, их вырезали из гелей, расщепляли трипсином и подвергали анализу MALDI-TOF/TOF MS.На основании критериев, описанных в материалах и методах, было успешно идентифицировано 49 белковых пятен (дополнительная таблица S1). Среди них семь пятен были идентифицированы как два белка, что привело к идентификации в общей сложности 54 различных белков (таблица, рисунок S3). Из этих идентифицированных белков 15 белков имели только инвентарный номер B. napus EST. Последовательности этих белков были внесены в базу данных Arabidopsis, чтобы лучше понять их функции (таблица).Для многих идентифицированных белков наблюдались различия между их экспериментальным и теоретическим pI и молекулярной массой. Несколько возможностей могут помочь объяснить этот результат. Во-первых, геном B. napus не полностью секвенирован и аннотирован, что может привести к отклонениям; во-вторых, некоторые белки могут подвергаться посттрансляционным модификациям или расщеплению. Анализ онтологии MapMan (Thimm et al., 2004) отсортировал все идентифицированные белки по 10 функциональным группам, включая метаболизм, назначение белка, реакцию на стресс, окислительно-восстановительный гомеостаз, развитие, связанные с гормонами, клеточную структуру, различные ферменты, запасные белки и функциональные белки. (таблица, рисунок).

Таблица 1

Идентификация дифференциально представленных белков в семенах рапса, подвергшихся искусственному старению .

Score 9109 9 9 9 9 9 9 9 9 Гормон связан 500010 Актин 9,1001077 / 65.64 9 9 9
Идентификатор белка Тип доступа Описание Экспл. ИП /г-н Тео. ИЭТ / Mr SC * Fold изменение **
0 ч 18 H 18 H
D2 # GI | 7525018 ATP Synthase 5.54 / 79.79 5.19 / 55.35 129 6 0,4 ± 0.12 1 ± 0.12 1 ± 0.12 GI | 131979 Rubisco Большой субъединица 6.64 / 51.92 6.23 / 51.98 276 9.5 0,97 ± 0,05 4. 3 ± 0,06
U19-1 # GI | 3549670 PuTiative Protein 6.04 / 69.15 6.34 / 47.12 49 2.8 9,3 ± 6.2 1 ± 0,06 1 ± 0,06 D22 GI | 166706 глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа 7.82 / 49.03 6.34 / 37.08 264 10.4 0,5 ± 0,3 0,96 ± 0,03
D38 GI | 11587 Безымянный белковый продукт 6.7 / 75.76 6.7 / 75.76 6.32 / 47.52 89 3.1 0,2 ± 0,06 1 ± 0.18
D44 gi|2497857 Предшественник малатдегидрогеназы 6.5/42.72 8.81 / 35.86 187 8 0.22 ± 0,03 0,2 ± 0,03 0,2 ± 0,03
D82-1 GI | 13605559 AT3G03250 / T17B222_6 5.82 / 69.32 5.93 / 51.85 81 5 5 0,42 ± 0,07 0,42 ± 0,07
Белкового белка
D13 Gi | 3086 UBI 3 Fusion Белок 6.51 / 10.41 9.82/17.34 80 8 0.15 ± 0,04 0,92 ± 0,06 0,92 ± 0,06 D26-1 Gi | 297796499 Ubiquitin1 5.34 / 21.31 5.14 / 17.83 72 7 0.37 ± 0.15 1.1 ± 0.21
U45-1
GI | 224119900 GI | 224119900 Прогнозируемый белок 6.02 / 69.12 5.8 / 48.35 98 4 1 ± 0.1 2±0.95
U45-2 # GI | 50814 Безымянный белок 6.02 / 69.12 5.4 / 44.69 87 4 1 ± 0,1 2 ± 0,95
D69 GI | 224119900 Прогнозируемый белок 6.44 / 62.75 5,8 / 481000 5,8 / 481000 4 4 0.5 ± 0.21 0.5 ± 0,21 0.4 ± 0,21 D70 GI | 14423532 Publative Chaperonin 6.33 / 73.01 5.83 / 5949 83 3 1 ± 0,05 –8 GI | 62321134 Гипотетический белок 5.75 / 514 5.55 / 40.59 208 7 1 ± 0.17 0,49 ± 0,02
D82-2 GI | 1709798 GI | 1709798 26S протеаз регулирующий субъединица 6B гомолог 5.82 / 69.32 5.3 / 46.67 62 2 0.92 ± 0,03 0,42 ± 0,07
D87-1 GI | 134037046 Treonine Endopeptididase 6.65 / 34.97 5.79 / 28.25 81 7 1,1 ± 0,16 0,5 ± 0,04
D87-2 GI | 2511592 Компонент протеасом 6.65 / 34.97 5.77 / 27.55 65 7 1.1 ± 0.16 0,5 ± 0,04 0,5 ± 0,04
Ответ на стресс
D27 gi|2326354 НМ белок теплового шока 5.12/2.35 7.35 7.88 / 23.59 81 4.3 0,2 ± 0,09 1.1 ± 0.18 1,1 ± 0.18 D33 Gi | 16340 Безымянный белковый продукт 6.27 / 21.82 5.21 / 17.44 47 5.8 0.5 ± 0,02 0.98 ± 0.13 D36 Gi | 157849708 17.6 KDA класс II тепловой ударный протеин 6.44 / 21.28 7.8 / 17.60 67 5 .8 0,46±0,02 1,1±0,03
U42 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”AM058901″,”term_id”:”72288723″, “term_text”:”AM058901″}}AM058901 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”AM058901.1″,”term_id”:”72288723″,”term_text”: “Am058901.1”}}} am058901.1 Brassica Rapa 5.83 / 23.52 5.83 / 23.52 5.47 / 15.2000 84 12 1.0 ± 0.17 3.7 ± 1,57 3,7 ± 1,57
D79 Gi | 115448989 Ос02г0774300 5.59/88.24 5.49 / 73.08 192 4 1.0 ± 0.11 0.3 ± 0,09 0.3 ± 0,07
D83 Gi | 16 Тепловой ударный протеин 5.8 / 98.62 4.97 / 80.23 96 3 3 0,99 ± 0,09 0,93 ± 0,08
READOX D269
D26-2 GI | 42 Type2 PeroxiredoxIn 5.34 / 21.31 5.37 / 17.55 53 6 0,4 ± 0,15 1.1 ± 0.21
D15 {“Тип”: “Entrez-Nucleotide”, “attrs”: {“Текст” :”CX267648″,”term_id”:”83819425″,”term_text”:”CX267648″}}CX267648 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”CX267648.1″ ,”term_id”:”83819425″,”term_text”:”CX267648.1″}}CX267648.1 Brassica rapa 6.82/63.74 7.19/22.34 71 10 9.101100±0,18 –∞
U18-1 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY004591″,”term_id”:”119422150″,”term_text “:”DY004591”}}DY004591 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”DY004591.1″,”term_id”:”119422150″,”term_text”:”DY004591 .1 “}} dy004591.1 brassica Rapa 5.87 / 19.93 5.87 / 19.93 9.12 / 26.25 239 12 2,9 ± 0,86 —∞ – ∞
D30-1 {” Тип “:” entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”DY003072″,”term_id”:”119420631″,”term_text”:”DY003072″}}DY003072 {“тип”:”entrez-нуклеотид”,” attrs”:{“текст”:”DY003072.1 “,” term_id “:” 119420631 “,” term_text “:” dy003072.1 “}} dy003072.1 brassica Rapa 5.39 / 31.11 5.04 / 22.93 78 9 0,4 ± 0,04 0,98±0,07
D30-2 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”CD828227″,”term_id”:”32510167″,”term_text”:”CD828227 “}}CD828227 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”CD828227.1″,”term_id”:”32510167″,”term_text”:”CD828227.1″} }CD828227.1 Brassica rapa 5.39 / 31.11 7.94 / 13.25 68 17 0.4 ± 0,04 0,98 ± 0,07
D37 # GI | 15226403 Chartin Family белок 6.63 / 29.66 7.1 /55.90 79 4,8 0,27 ± 0,16 1.1 ± 0,07 1,1 ± 0,07
U44 {“Тип”: “Entrez-Nucleotide”, “Attrs”: {“Текст”: “EV179242″, ” term_id”:”151268881″,”term_text”:”EV179242″}}EV179242 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”EV179242.1 “,” term_id “:” 151268881 “,” term_text “:” EV179242.1 “}}} rev179242.1 brassica Rapa 5.81 / 63.46 9.71 / 31.49 69 5 1.0 ± 0.2 3,3±0,79
D74 # {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY001490″,”term_id”:”119419049″,”term_text”:” DY001490″}}DY001490 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”DY001490.1″,”term_id”:”119419049″,”term_text”:”DY001490.1″ }}DY001490.1 Brassica rapa 7.39 / 42.53 9.78 / 22.11 72 9 1.0 ± 0,08 0.3 ± 0.12 969
D76 # GI | 461840 CRUCIFERIN CRU1 5.57 / 11.55 7.64 / 56.87 287 5 1,0 ± 0,04 0,5 ± 0,07 0,5 ± 0,07
d90 {“Тип”: “Энтрез-нуклеотид”, “attrs”: {“текст”: “Dy002799”, “term_id “:”119420358″,”term_text”:”DY002799″}}DY002799 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY002799.1 “,” term_id “:” 119420358 “,” term_text “:” dy002799.1 “}}} dy002799.1 Brassica Rapa 6.68 / 43.73 5.16 / 22.40 175 20 1.0 ± 0,09 0,2 ± 0.12
69 D31 GI | 556805 EM Protein 5.66 / 15.94 6.65 / 9.94 245 28,3 0,26 ± 0,02 1.0 ± 0,02 1.0 ± 0,12
КЛЕТОЧНАЯ СТРУКТУРА
U27 # gi|48527433 5.24 / 41.95 156 10 2,9 ± 0, 2,9 ± 0,91 1.0 ± 0.11 9
U43 # GI | 6628 actin 5.87 / 60.76 5.3 / 42.02 102 4 1.0 ± 0,09 3.1 ± 0,72
Разные ферменты
D11 # D11 GI | 12322163 Дорман, связанный с белком 6.57 / 41.16 5.92 / 31.41 88 3.8 0.54 ± 0.11 1.0 ± 0.16
U13 # D64 GI | 34222076 Mannose-Beick Lectin Superfamily Белок 6.9 / 43.39 6.03 / 494 6.03 / 49.25 87 4 4.1 ± 0,07 1,1 ± 0,07 U19
U19-2 # GI | 159470791 гликосилтрансферазы 6.04 / 69.15 8.95 / 57.22 46 2.8 9,6 ± 6.2 1.0 ± 0,06 U26-2 GI | 757740 Beta-Glucosidase 7.19 / 81.48 6.21 / 58,47 112 2.5 2.5 ± 0.56 1.0 ± 0.10
U50 # Gi | 12322163 Gi | 12322163 Дорман, связанный с белком 6.71 / 37.1 5.92 / 31.41 95 3 1.0 ± 0.11 2.1 ± 0.62
D88 # Gi | 12322163 Содружественное белок 6.65 / 38.64 5.92 / 31.41 74 3 1.0 ± 0.17 0.62 ± 0.27
D92 GI | 757740 Бета-глюкозидаза 6.89 / 92.86 6.21 / 58.92 6.21 / 58.92 72 3 1,0 ± 0,08 274 ± 26
Складские белки
D37 gi|15226403 Белок семейства купинов 6.63/29.66 7.1 / 55.90 79 4.8 0.5 ± 0.16 1.0 ± 0.11 1,0 ± 0.11
U41 GI | 167136 Cruciferin Precurors 5.68 / 72.89 6.84 / 56.43 92 3 0,99 ± 0,08 2,5 ± 0,01 2,5 ± 0,01 D75 GI | 166678 GI | 166678 12s Хранение CRB CRB 5.5 / 10.82 6.77 / 50.95 158 3 0.98 ± 0.11 0.56 ± 0,07
D84 GI | 166678 12s Хранение белков CRB 6.19 / 17.83 6.77 / 50.95 79 3 1,0 ± 0.10 172 ± 34
D85 D85 # GI | 166678 12S хранения белка CRB 6.4 / 37.1 6.77 / 50,95 63 3 1,0 ± 0,05 0,33 ± 0.13
UNASSIGNED
D7 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY002554″,”term_id”:”119420113″,”term_text”:”DY002554″}} DY002554 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”DY002554.1 “,” term_id “:” 119420113 “,” term_text “:” Dy002554.1 “}}} dy002554.1 brassica Rapa 5.46 / 31.37 8.71 / 16.29 231 22 0,46 ± 0,03 0,43±0,07
U18-2 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY002789″,”term_id”:”119420348″,”term_text”:”DY002789 “}}DY002789 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”DY002789.1″,”term_id”:”119420348″,”term_text”:”DY002789.1″} }DY002789.1 Brassica rapa 5.87 / 19.93 9.35 / 2444 9.35 / 24.44 205 14 2,9 ± 0,39 -∞
D41 {«Тип»: «Entrez-Nucleotide», «attrs»: {“текст”: “DY002558″,”term_id”:”119420117″,”term_text”:”DY002558″}}DY002558 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”DY002558.1″, «TERM_ID»: «119420117», «TERM_TEXT»: «DY002558.1»}}} DY002558.1 Brassica Rapa 7.2 / 110.01 5.29 / 24,81 78 8 0,4 ± 0.20 1.0±0,08
U48 # {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”CX278338″,”term_id”:”83830115″,”term_text”:” CX278338″}}CX278338 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”CX278338.1″,”term_id”:”83830115″,”term_text”:”CX278338.1″ }}} CX278338.1 Brassica Rapa 6.4 / 38.37 9.03 / 27.2011 9011 276 18 0.99 ± 0.15 2,9 ± 0,64 2,5 ± 0,64
D71 {“Тип”: “Entrez-Nucleotide” ,”attrs”:{“text”:”DY002554″,”term_id”:”119420113″,”term_text”:”DY002554″}}DY002554 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{ “текст”:”DY002554.1 “,” term_id “:” 119420113 “,” term_text “:” dy002554.1 “}} dy002554.1 brassica Rapa 6.88 / 84.95 8,71 / 16.29 100 13 1.1 ± 0.21 –∞
D78 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”DY002558″,”term_id”:”119420117″,”term_text”:”DY002558″}} DY002558 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”DY002558.1″,”term_id”:”119420117″,”term_text”:”DY002558.1″}}DY002558. 1 Brassica rapa 5.64/2001.73 5.29 / 24.81 83 8 0,97 ± 0,07 –∞

Таблица 2

Взрыв идентифицированных белков через поиск на Brassica Napus EST База данных .

8410110 3ress 00 9410110 9 1003 Не присвоено
Идентификатор белка Номер доступа . AGI № . Описание Описание Оценка 2 Identity (%) Функциональная группа
D7 {«Тип»: «Entrez-Nucleotide», «attrs»: {” Текст “:” dy002554 “,” term_id “:” 119420113 “,” term_text “:” Dy002554 “}}} dy002554 at2g42560 at2g42560 at2g42560 79 47 Безопасный {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”CX267648″,”term_id”:”83819425″,”term_text”:”CX267648″}}CX267648 AT2G36640 Эмбриональная клетка белок 63 164 51 Разработка
D30-1 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY003072″,”term_id2″:”631942″:”131 “,”term_text”:”DY003072″}}DY003072 AT2G28490 RmlC-подобный белок надсемейства купинов 266 76 Развитие
D30-2 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”CD828227″,”term_id”:”32510167″,”term_text”:”CD828227″} } CD828227 AT2G28490 RMLC-подобные чашки Superfamily Белок 79 63 Разработка
D41 {“Тип”: “Entrez-Nucleotide”, “Attrs”: {“Текст”: ” Dy002558 “,” term_id “:” 119420117 “,” term_text “:” dy002558 “}} dy002558 at2g42560 at2g42560 at2g42560 at2g42560 172 55 Безопасное D58 {” Тип “:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”DY001351″,”term_id”:”119418910″,”term_text”:”DY001351″}}DY001351 AT5G45690 Белок неизвестной функции (DUF1264 ) 369 82 Не назначено
D74 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY001490″,”term_id”:”9094″1194 term_text”:”DY001490″}}DY0 01490 AT3G22640 AT3G22640 Charmin Family белок 185 68 Development 69
D71 {“Тип”: “Entrez-Nucleotide”, “Attrs”: {“Текст”: “Dy002554″, ” term_id”:”119420113″,”term_text”:”DY002554″}}DY002554 AT2G42560 Белок, содержащий домен LEA 78.6 47 Не назначено
D78 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY002558″,”term_id”:”119420117″,”term_text”: “Dy002558”}}} dy002558 at2g42560 at2g42560 lea domain -содержащий белок 172 55 Unanceed Unanceed d90 {“Тип”: “Entrez-nucleotide”, “attrs”: {“текст “:” Dy002799 “,” term_id “:” 119420358 “,” term_text “:” Dy002799 “}} dy002799 AT3G22640 AT3G22640 AT3G22640 Chartin Family белок 290 70 Development
U18-1 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY004591″,”term_id”:”119422150″,”term_text”:”DY004591″}}DY004591 AT1G03890 RmlC-подобный белок надсемейства купинов 299 78 Разработка
U18-2 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”DY002789″,”term_id”: 119420348″,”т ERM_TEXT “:” DY002789 “}} dy002789 AT5G01300 PEBP (фосфатидилэтаноламиновый белковый белок) Семейный белок 302 859 Неопределенные U42 {” Тип “:” Entrez-nucleotide “, “attrs”:{“text”:”AM058901″,”term_id”:”72288723″,”term_text”:”AM058901″}}AM058901 AT2G21060 Богатый глицином белок 2B 145 0
U44 {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“текст”:”EV179242″,”term_id”:”151268881″,”term_text”:”EV179242″}}EV179242 AT3G53040 Белок, содержащий домен LEA 117 52 Развитие
U48 {“type”:”3C”,”atrez-нуклеотид”:2″type”:”atrez-нуклеотид term_id”:”83830115″,”term_text”:”CX278338″}}CX278338 AT5G45690 Белок с неизвестной функцией (DUF1264) 277 82

Белковые функциональные категории дифференциально отображаемых белков .Функциональная категоризация проводилась в соответствии с MapMan (Thimm et al., 2004). Цифровые числа обозначают количество белков в каждой группе.

Влияние АБК и ГА на старение семян

Поскольку после обработки CDT не наблюдалось существенных различий в концентрациях АФК и активности антиоксидантных ферментов, мы предположили, что окислительный стресс не является основным фактором, участвующим в ингибировании прорастания после обработки CDT. . Таким образом, можно было ожидать участие каких-то других факторов, которые привели к задержке прорастания после обработки CDT.Среди всех внешних и внутренних факторов АБК, по-видимому, является наиболее важным фактором, тормозящим прорастание семян. Поэтому мы измерили содержание АБК в семенах ЦК и CDT как через 0, так и через 18 ч после набухания. Интересно, что содержание АБК в семенах CDT было намного выше, чем в семенах CK в обе временные точки, и показало резкое снижение при набухании в обоих образцах (рис. 2), что свидетельствует об участии АБК в старении семян. Для дальнейшего подтверждения этой гипотезы семена ЦК проращивали в присутствии АБК, и они показали задержку прорастания (рис. 1).Известно, что ГА и АБК играют антагонистические роли в регуляции прорастания семян, поэтому мы также проращивали семена CDT в присутствии ГА, чтобы увидеть, может ли эта обработка восстановить их фенотип прорастания или нет. Соответственно, семена CDT, обработанные GA, демонстрировали частично восстановленную всхожесть (рис. ).

Содержание АБК в семенах Brassica napus , подвергшихся обработке CDT во время прорастания . Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка для трех биологических повторов. ** указывают на значительную разницу при P < 0.01.

Влияние АБК и ГА на всхожесть семян Brassica napus . Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка для трех биологических повторов.

Обсуждение

Температура и содержание влаги (относительная влажность) являются двумя важными факторами окружающей среды, влияющими на старение семян. Высокая температура и влажность ускоряют процесс старения семян, что приводит к быстрой потере их всхожести. Ускоренное старение применялось в качестве показателя сохраняемости семян сельскохозяйственных культур (Priestley, 1986).Чтобы изучить механизм старения семян, исследователи разработали протокол ускоренного старения в лаборатории, подвергая семена воздействию высокой температуры и влажности (Job, 2005; El-Maarouf-Bouteau et al., 2011). Предполагается, что АФК являются основными факторами, приводящими к старению семян при хранении (Bailly et al., 1996; Bailly, 2004; Kibinza et al., 2006; Parkhey et al., 2012). Чтобы понять механизмы, лежащие в основе старения семян B. napus , особенно на стадии инициации, мы подвергли B.napus с CDT, что явно задерживало прорастание и немного снижало скорость прорастания, которая была аналогична семенам естественного возраста в течение 1 года (рис. ). Эти результаты свидетельствуют о том, что эта обработка подходит для дальнейшего анализа, поскольку она может имитировать физиологию семян естественного возраста в течение 1 года.

CDT привел к увеличению утечки ионов (рис. ), что отражает повреждение клеточных мембран. Это повреждение, в свою очередь, привело к накоплению МДА в семенах CDT (рис. 1).Ранее считалось, что атака АФК на мембраны может быть одной из причин, приводящих к утечке ионов (Leymarie et al., 2012). Кроме того, предыдущее исследование также показало, что высокая температура и влажность резко увеличивают степень окисления белка в семенах арабидопсиса (Rajjou et al., 2008). Однако после ЦДТ в семенах B. napus мы не обнаружили избыточного накопления АФК (рис. 2) и дифференцированного накопления антиоксидантных ферментов, кроме пероксиредоксина (табл. 1).Поскольку было обнаружено всего около 500 белков, нельзя было полностью исключить, что были изменены некоторые антиоксидантные ферменты. Несмотря на это, CDT снижал скорость детоксикации АФК во время прорастания (рис. 1), что позволяет предположить, что искусственное старение может нарушить систему удаления АФК. Этот результат также был подтвержден снижением активности SOD и CAT (рис. ). CDT может снижать активность антиоксидантных ферментов из-за высокой температуры, поскольку большинство ферментов проявляют максимальную активность при температуре около 35°C в физиологических условиях.

Функциональная классификация идентифицированных белков показала, что белки, связанные с модификацией и назначением белков, развитием и клеточной структурой, по-разному модулировались после CDT. Однако предыдущие исследования семян гороха (Barba-Espin et al., 2011) и пшеницы (Bykova et al., 2011) показали, что обработка H 2 O 2 предпочтительно регулирует белки, в основном участвующие в окислительно-восстановительном гомеостазе, метаболизме, связаны с гормонами и РНК, и это может вызывать изменения белков с аналогичными функциями в разных тканях (Wan and Liu, 2008; Zhou et al., 2011). Различия в дифференциально накопленных белках в этом исследовании с ранее опубликованными отчетами по гороху и пшенице позволяют предположить, что механизм старения семян в семенах B. napus совершенно отличается от механизма старения семян гороха и пшеницы. Наши результаты показывают, что обработка CDT может инициировать старение семян B. napus за счет усиления биосинтеза ингибиторов прорастания и, в последнее время, за счет накопления АФК. Несмотря на то, что между семенами CK и CDT был обнаружен 81 дифференцированный белок, только 49 пятен были успешно идентифицированы.Уровень идентификации составляет всего около 60%, что может быть объяснено несеквенированным геномом B. napus . Более того, семь пятен были идентифицированы как два разных белка, что должно затруднить оценку реального содержания каждого белка в них. Это одно из ограничений протеомных методов на основе двумерного геля. Будущие исследования безгелевых систем могут помочь предоставить больше информации.

Поскольку обработка CDT задерживает прорастание не в первую очередь из-за накопления АФК, мы предположили, что должны быть какие-то другие механизмы, которые опосредуют процесс старения семян у B.семена напус . Среди идентифицированных белков большая часть белков, участвующих в метаболизме и назначении белков, была снижена в семенах CDT. Эти результаты показывают, что основная биологическая активность может подавляться обработкой CDT, что приводит к задержке прорастания. Интересно, что большая субъединица rubisco увеличивалась в семенах, обработанных CDT, через 18 ч после прорастания, что указывает на наличие регуляции по принципу обратной связи. В отличие от белков, связанных с метаболизмом и назначением белка, многие клеточные структурные белки и различные ферменты, такие как актин, маннозо-связывающий белок суперсемейства лектинов, гликозилтрансфераза, бета-глюкозидаза, были повышены.Все эти белки связаны со структурами клетки и клеточной стенки. Было бы интересно узнать, как эти белки влияют на старение семян.

Сообщается, что среди всех внутренних факторов АБК является одним из основных факторов, подавляющих прорастание семян (Gubler et al., 2005; Finch-Savage and Leubner-Metzger, 2006; Penfield et al., 2006). Измерения содержания АБК в семенах B. napus показали резкое увеличение содержания АБК в семенах, обработанных CDT (рис. ).Хотя АБК разлагалась во время прорастания, ее концентрация была все же выше в семенах, обработанных CDT, по сравнению с семенами, обработанными CK (рис. 1). Кроме того, пропитка семян ЦК раствором АБК показала задержку прорастания (рис. ). Прорастание семян, обработанных CDT, частично восстановилось после обработки GA, что еще раз подтверждает участие АБК в ингибировании прорастания семян при старении. Однако то, как эта концентрация АБК увеличивается во время обработки старением в B.napus , все еще неуловим. К сожалению, мы не обнаружили каких-либо изменений ферментов, участвующих в биосинтезе и деградации АБК. Хорошо известно, что АБК синтезируется в семенах во время высыхания, что позволяет семенам выживать в сухом состоянии (Tan et al., 1997; Nakabayashi et al., 2005). В ходе этого процесса была обнаружена высокая экспрессия генов, участвующих в биосинтезе АБК, и обильное накопление соответствующих ферментов. Основываясь на этих результатах, мы предполагаем, что воздействие на семена высокой влажности и температуры может частично восстановить активность ферментов биосинтеза АБК, что приводит к усилению продукции АБК в штамме B.napus в процессе старения.

Вклад авторов

YX проводил эксперименты; HD подготовил семена и проанализировал некоторые данные; YP разработал эксперименты и написал рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность г-же Тинтин Ли из Института гидробиологии Китайской академии наук за помощь в проведении MALDI-TOF/TOF MS анализа.Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC, № 31271805), программой 100 талантов Китайской академии наук и китайско-африканским совместным исследовательским проектом (SAJC201324).

Ссылки

  • Bailly C. (2004). Активные формы кислорода и антиоксиданты в биологии семян. Семенная наука. Рез. 14, 93–107 10.1079/SSR2004159 [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bailly C., Benamar A., ​​Corbineau F., Come D. (1996). Изменения содержания малонового диальдегида и активности супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионредуктазы в семенах подсолнечника в связи с ухудшением состояния при ускоренном старении.Физиол. Растение. 97, 104–110 10.1111/j.1399-3054.1996.tb00485.x [CrossRef] [Google Scholar]
  • Барба-Эспин Г., Диас-Виванкос П., Джоб Д., Бельгази М., Джоб С., Эрнандес Дж. А. (2011). Понимание роли H (2) O (2) во время прорастания семян гороха: комбинированный подход к протеомному и гормональному профилированию. Окружающая среда растительной клетки. 34, 1907–1919. 10.1111/j.1365-3040.2011.02386.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Бенцинк Л., Джоуэтт Дж., Ханхарт С.Дж., Корнниф М. (2006). Клонирование DOG1, локуса количественного признака, контролирующего покой семян арабидопсиса.проц. Натл. акад. науч. США 103, 17042–17047. 10.1073/pnas.0607877103 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bewley J.D. (1997). Прорастание семян и период покоя. Растительная клетка 9, 1055–1066. 10.1105/tpc.9.7.1055 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bradford MM (1976). Быстрый и чувствительный метод количественного определения белка в микрограммах, использующий принцип связывания белка с красителем. Анальный. Биохим. 72, 248–254. 10.1016/0003-2697(76)

    -3 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Быкова Н.В., Хен Б., Рампитч К., Бэнкс Т., Стеббинг Дж. А., Фан Т. и др. . (2011). Стратегии редокс-чувствительного протеома и антиоксидантов в контроле покоя семян пшеницы. протеомика 11, 865–882. 10.1002/pmic.200

    0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Chatelain E., Satour P., Laugier E., Ly Vu B., Payet N., Rey P., et al. . (2013). Доказательства участия системы репарации метионинсульфоксидредуктазы в долговечности семян растений. проц. Натл. акад. науч. США 110, 3633–3638. 10.1073/пнас.1220589110 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Chen M.L., Fu X.M., Liu J.Q., Ye T.T., Hou S.Y., Huang Y.Q., et al. . (2012). Высокочувствительное и количественное профилирование кислых фитогормонов с использованием подхода дериватизации в сочетании с анализом нано-ЖХ-ESI-Q-TOF-MS. Ж. Хроматогр. Б 905, 67–74. 10.1016/j.jchromb.2012.08.005 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Chi F., Yang P., Han F., Jing Y., Shen S. (2010). Протеомный анализ проростков риса, инфицированных Sinorhizobium meliloti 1021.протеомика 10, 1861–1874 гг. 10.1002/pmic.200

    4 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Clerkx E.J., El-Lithy M.E., Vierling E., Ruys G.J., Blankestijn-De Vries H., Groot S.P., et al. . (2004). Анализ естественной аллельной изменчивости признаков всхожести и долговечности семян арабидопсиса между образцами Landsberg erecta и Shakdara с использованием популяции новой рекомбинантной инбредной линии. Завод Физиол. 135, 432–443. 10.1104/pp.103.036814 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Corbineau F., Гей-Матье К., Винель Д., Ком Д. (2002). Снижение жизнеспособности семян подсолнечника ( Helianthus annuus ), вызванное высокой температурой, связанное с энергетическим обменом, повреждением мембран и липидным составом. Физиол. Растение. 116, 489–496 10.1034/j.1399-3054.2002.1160407.x [CrossRef] [Google Scholar]
  • Debaujon I., Leon-Kloosterziel K.M., Koornneef M. (2000). Влияние кожуры на покой семян, всхожесть и продолжительность жизни арабидопсиса. Завод Физиол. 122, 403–414. 10.1104/стр.122.2.403 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Эллис Р. (1992). Энергия семян и рассады в зависимости от роста и урожайности культур. Регулятор роста растений. 11, 249–255 10.1007/BF00024563 [CrossRef] [Google Scholar]
  • El-Maarouf-Bouteau H., Mazuy C., Corbineau F., Bailly C. (2011). Изменение ДНК и запрограммированная гибель клеток при старении семян подсолнечника. Дж. Эксп. Бот. 62, 5003–5011. 10.1093/jxb/err198 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Finch-Savage W.Э., Лейбнер-Мецгер Г. (2006). Покой семян и контроль прорастания. Новый Фитол. 171, 501–523. 10.1111/j.1469-8137.2006.01787.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Гарса-Калигарис Л.Е., Авендано-Васкес А.О., Альварадо-Лопес С., Зунига-Санчес Э., Ороско-Сеговия А. , Перес-Руис Р.В. и др. . (2012). Транскрипт At3g08030: молекулярный маркер старения семян. Анна. Бот. 110, 1253–1260. 10.1093/aob/mcs200 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Grant J.Дж., Лоак Г.Дж. (2000). Роль активных промежуточных соединений кислорода и родственной окислительно-восстановительной сигнализации в устойчивости к болезням. Завод Физиол. 124, 21–29. 10.1104/pp.124.1.21 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Гублер Ф., Миллар А. А., Якобсен Дж. В. (2005). Выход из состояния покоя, АВА и предуборочное проращивание. Курс. мнение биол. растений 8, 183–187. 10.1016/j.pbi.2005.01.011 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • He D., Han C., Yang P. (2011). Изменения профиля экспрессии генов в прорастающем рисе.Дж. Интегр. биол. растений 53, 835–844 10.1111/j.1744-7909.2011.01074.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Holdsworth M.J., Bentsink L., Soppe W.J. (2008). Молекулярные сети, регулирующие созревание, дозревание, покой и прорастание семян арабидопсиса. Новый Фитол. 179, 33–54. 10.1111/j.1469-8137.2008.02437.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Jaw-Neng Lin C.H.K. (1998). Влияние окислительного стресса, вызванного перекисью водорода, на старение листьев риса. Бот. Бык.акад. Грех. 39, 161–165. [Google Scholar]
  • Джоб С. (2005). Закономерности окисления белков в семенах арабидопсиса и при прорастании. Завод Физиол. 138, 790–802. 10.1104/pp.105.062778 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Kibinza S., Vinel D., Come D., Bailly C., Corbineau F. (2006). Ухудшение качества семян подсолнечника в зависимости от содержания влаги в процессе старения, энергетического обмена и поглощения активных форм кислорода. Завод Физиол. 128, 496–506 10.1111/j.1399-3054.2006.00771.x [CrossRef] [Google Scholar]
  • Kruger NJ (1994). Метод Брэдфорда для количественного определения белка. Основные методы Мол. биол. 32, 9–15. [PubMed] [Google Scholar]
  • Lee J., Welti R., Roth M., Schapaugh W.T., Li J., Trick H.N. (2012). Повышение жизнеспособности семян и изменение состава липидов при естественном старении за счет подавления фосфолипазы D-альфа в семенах сои. Биотехнология растений. Ж. 10, 164–173. 10.1111/j.1467-7652.2011.00650.x [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Leymarie J., Виткаускайте Г., Хоанг Х. Х., Жендро Э., Шазул В., Меймун П. и др. . (2012). Роль активных форм кислорода в регуляции покоя семян арабидопсиса. Физиология клеток растений. 53, 96–106. 10.1093/pcp/pcr129 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Li M., Sha A., Zhou X., Yang P. (2012). Сравнительный протеомный анализ выявляет изменения метаболических свойств в пестиках сои ( Glycine max ) при опылении. Секс. Завод Репрод. 25, 281–291. 10.1007/s00497-012-0197-0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Миура К., Лин Ю., Яно М., Нагамин Т. (2002). Картирование локусов количественных признаков, контролирующих долговечность семян риса ( Oryza sativa L.). Теор. заявл. Жене. 104, 981–986. 10.1007/s00122-002-0872-x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Накабаяши К., Окамото М., Косиба Т., Камия Ю., Намбара Э. (2005). Полногеномное профилирование хранимой мРНК в прорастании семян Arabidopsis thaliana : эпигенетическая и генетическая регуляция транскрипции в семенах. Завод Ж. 41, 697–709. 10.1111/Дж.1365-313X.2005.02337.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Neill S., Desikan R., Hancock J. (2002). Сигнализация перекисью водорода. Курс. мнение биол. растений 5, 388–395. 10.1016/S1369-5266(02)00282-0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Oge L., Bourdais G., Bove J., Collet B., Godin B., Granier F., et al. . (2008). Репарация белка L-изоаспартилметилтрансфераза 1 участвует как в долговечности семян, так и в силе прорастания арабидопсиса. Растительная клетка 20, 3022–3037. 10.1105/тпк.108.058479 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Parkhey S., Naithani S.C., Keshavkant S. (2012). Продукция АФК и катаболизм липидов при высушивании семян Shorea robusta в процессе старения. Завод Физиол. Биохим. 57, 261–267. 10.1016/j.plaphy.2012.06.008 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Пенфилд С., Ли Ю., Гилдей А. Д., Грэм С., Грэм И. А. (2006). Arabidopsis, ABA INSENSITIVE4, регулирует мобилизацию липидов в зародыше и выявляет подавление прорастания семян эндоспермом.Растительная клетка 18, 1887–1899. 10.1105/tpc.106.041277 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Priestley DA (1986). Старение семян: последствия для хранения семян и устойчивости в почве. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Издательство Корнельского университета. [Google Scholar]
  • Прието-Дапена П., Кастано Р., Альмогера К., Джордано Дж. (2006). Улучшенная устойчивость к контролируемой порче трансгенных семян. Завод Физиол. 142, 1102–1112. 10.1104/pp.106.087817 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Rajjou L., Дюваль М., Галлардо К., Катус Дж., Балли Дж., Джоб С. и др. . (2012). Всхожесть и энергия семян. Анну. Преподобный завод биол. 63, 507–533. 10.1146/annurev-arplant-042811-105550 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Rajjou L., Lovigny Y., Groot S.P.C., Belghazi M., Job C., Job D. (2008). Протеомная характеристика старения семян арабидопсиса: сравнение протоколов искусственного и естественного старения. Завод Физиол. 148, 620–641. 10.1104/pp.108.123141 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Sattler S.Э., Гиллиланд Л.У., Магалланес-Лундбак М., Поллард М., ДеллаПенна Д. (2004). Витамин Е необходим для долговечности семян и предотвращения перекисного окисления липидов во время прорастания. Растительная клетка 16, 1419–1432. 10.1105/tpc.021360 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Shi H., Wang Y., Cheng Z., Ye T., Chan Z. (2012). Анализ естественной изменчивости бермудской травы ( Cynodon dactylon ) выявил физиологические реакции, лежащие в основе засухоустойчивости. ПЛОС ОДИН 7:e53422.10.1371/journal.pone.0053422 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Tan B.C., Schwartz S.H., Zeevaart J.A., McCarty D.R. (1997). Генетический контроль биосинтеза абсцизовой кислоты в кукурузе. проц. Натл. акад. науч. США 94, 12235–12240. 10.1073/pnas.94.22.12235 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Тимм О., Блсинг О., Гибон Ю., Нагель А., Мейер С., Крюгер П. и др. . . (2004). MAPMAN: управляемый пользователем инструмент для отображения наборов геномных данных на диаграммах метаболических путей и других биологических процессов.Завод Ж. 37, 914–939. 10.1111/j.1365-313X.2004.02016.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Верма П., Каур Х., Петла Б. П., Рао В., Саксена С. К., Маджи М. (2013). БЕЛОК L-ИЗОАСПАРТИЛМЕТИЛТРАНСФЕРАЗА 2 по-разному экспрессируется в нуте и повышает силу и продолжительность жизни семян за счет снижения аномального накопления изоаспартила преимущественно в ядерных белках семян. Завод Физиол. 161, 1141–1157 10.1104/pp.112.206243 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Walters C., Wheeler LM, Grotenhuis JM (2005). Долговечность семян, хранящихся в генбанке: видовая характеристика. Семенная наука. Рез. 15, 1–20 10.1079/SSR2004195 [CrossRef] [Google Scholar]
  • Wan X.-Y., Liu J.-Y. (2008). Сравнительный протеомный анализ выявляет тесную белковую сеть, спровоцированную стрессом перекиси водорода в листьях проростков риса. Мол. Клетка. протеомика 7, 1469–1488. 10.1074/mcp.M700488-MCP200 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Yang P., Li X., Wang X., Чен Х., Чен Ф., Шен С. (2007). Протеомный анализ семян риса (Oryza sativa) при проращивании. протеомика 7, 3358–3368. 10.1002/pmic.200700207 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Чжоу Л., Бохари С. А., Донг С. Дж., Лю Дж. Ю. (2011). Сравнительный протеомный анализ корневых апопластов проростков риса в ответ на пероксид водорода. ПЛОС ОДИН 6:e16723. 10.1371/journal.pone.0016723 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Прочность на излом искусственно состаренных 3-компонентных адгезивных несъемных частичных протезов из армированных волокном композитов и керамики: исследование in vitro

Цель: Целью этого исследования in vitro было изучение прочности на излом неметаллических 3-компонентных адгезивных несъемных частичных протезов (AFPD), прикрепленных к нижнечелюстным резцам.

Метод и материалы: Извлеченные человеческие резцы были помещены парами в полиметилметакрилатную смолу, имитируя клиническую переднюю ситуацию. Их лингвальные стороны были подготовлены для адгезивных ретейнеров с поверхностями и отделочными линиями в эмали. Было изготовлено восемь AFPD по 3 единицы на мастер-модели для каждой системы материалов: Connect/belleGlass (Girrbach), StickNet (StickTech)/Sinfony (3M Espe) и Empress 2 (Ivoclar Vivadent).Протезы были приклеены с помощью системы двойного отверждения ED Primer/Panavia F (Kuraray Europe) и состарены с помощью термоциклирования (6000 x 5 градусов C/55 градусов C·h3O; 2 минуты каждый цикл) и механической нагрузки (1,2 x 106 ) x 20 Н при частоте 1,66 Гц) в искусственной среде полости рта, что соответствует сроку ношения 5 лет. Прочность на излом определяли на универсальной испытательной машине (UTM 1446, Zwick) со скоростью 1 мм/мин, прикладывая нагрузку к промежуточным звеньям щечно-инцисально. Различные формы отказа были описаны оптически.Были рассчитаны медианы (25-й/75-й процентили) результатов перелома. Статистический анализ проводили с использованием U-тестов Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса (P < или = 0,05).

Результаты: Пять AFPD StickNet/Sinfony и 7 реставраций Empress 2 не сработали в искусственной полости рта. Остальные протезы Empress 2 показали самые высокие медианы силы разрушения (339 [200/506] Н) по сравнению с Connect/belleGlass (257 [242/310] Н) и StickNet/Sinfony (256 [204/347] Н).Статистические сравнения не показали существенных различий.

Заключение: Только Connect/belleGlass и Empress 2 продемонстрировали достаточную устойчивость к пережевыванию.

Структурная и механическая реакция искусственно состаренного алюминиевого сплава 6061

  • Р. Э. Сандерс-младший, «Технологические инновации в алюминиевых изделиях», JOM , 53 , 21–25 (2001).

    КАС Статья Google ученый

  • И. Питер и М. Россо, Легкие сплавы — от традиционных к инновационным технологиям , в: З. Ахмад (ред.), Новые тенденции в разработке, характеристике и применении сплавов , InTech, Риека, Хорватия (2015 г.), https://doi.org/10.5772/60769.

  • X. Duan, Z. Mi, H. Jiang, et al., «Быстрое прокаливание сплава Al-Mg-Si во время двухступенчатой ​​термообработки перед старением», Mater.Рез. Экспресс , 6 , №7, 076576 (2019).

    КАС Статья Google ученый

  • В. С. Миллер, Л. Чжуан, Дж. Боттема и др., «Последние разработки алюминиевых сплавов для автомобильной промышленности», Мат. науч. англ. А-Структура. , 280 , 37–49 (2000).

    Артикул Google ученый

  • С. М. Раджаа, Х. А. Абдулхади, К.С. Джабур и Г. Р. Мохаммад, «Влияние времени старения на механические свойства сплава Al 6061-T6», Eng. Технол. заявл. науч. Рез. , 8 , 3113–3115 (2018).

    Артикул Google ученый

  • Г. А. Эдвардс, К. Стиллер, Г. Л. Данлоп и М. Дж. Купер, «Последовательность осаждения в сплавах Al-Mg-Si», Acta Mater. , 46 , № 11, 3893–3904 (1998).

    КАС Статья Google ученый

  • О.Энглер, С. Д. Мариоара, Ю. Аруга и др., «Влияние естественного старения или предварительного старения на эволюцию структуры и прочности выделений во время старения сплава Al-Mg-Si AA 6016», Мат. науч. англ. А-Структура. , 759 , 520–529 (2019).

    КАС Статья Google ученый

  • D. Maisonnette, M. Suery, D. Nelias и др., «Влияние термической обработки на микроструктуру и механические свойства алюминиевого сплава 6061», Mat.науч. англ. А-Структура. , 528 , № 6, 2718–2724 (2011).

    Артикул Google ученый

  • Б. К. Барнвал, Р. Рагван, А. Тевари и К. Нарасимхан, «Влияние микроструктуры и текстуры на поведение при формовании листа из алюминиевого сплава AA-6061», Мат. науч. англ. A-Struct ., 679 , 56–65 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • С.Раджасекаран, Н.К. Удаяшанкар и Дж. Наяк, «Обработка Т4 и Т6 композита 6061 Al-15 об.% SiC P », ISRN Mater. науч. , 2012 , идентификатор статьи 374719 (2012 г.), https://doi.org/10.5402/2012/374719.

  • М. Мураяма и К. Хоно, «Предварительно осажденные кластеры и процессы осаждения в сплавах Al–Mg–Si», Acta Mater ., 47 , № 5, 1537–1548 (1999).

    КАС Статья Google ученый

  • Д.Терада, Ю. Канда, З. Хорита и др., «Механические свойства и микроструктура алюминиевого сплава 6061, сильно деформированного в процессе ARB и впоследствии состаренного при низких температурах», IOP Conf. сер.-мат. науч. , 63 , 012088 (2014).

    КАС Google ученый

  • М. Мансуринеджад и Б. Мирзахани, «Влияние последовательности холодной обработки давлением и старением на механическое поведение алюминиевого сплава 6061», Т.Nonferr. Металл. соц. , 22 , № 9, 2072–2079 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • С. Ф. Тан и М. Р. Саид, «Влияние испытания на твердость на дисперсионно-твердеющий алюминиевый сплав 6061-T6», Chiang Mai J. Sci. , 36 , 276–286 (2009).

    КАС Google ученый

  • А. Х. Нароникар, Х. Н. Акшай Джамадагни, Амрутамшу Симха и Б.Сайкиран, «Оптимизация параметров термообработки Al-6061, необходимых для улучшения формуемости», Mater. Сегодня-Proc. , 5 , № 11, 24240–24247 (2018).

    КАС Статья Google ученый

  • З. Лян, Исследование осаждения сплавов Al-Mg-Si с различной термообработкой , магистерская диссертация, Южно-Китайский технологический университет (2009).

    Google ученый

  • О.Энглер, Дж. Хирш и К. Люкке, «Развитие текстуры в Al-1,8 мас.% Cu в зависимости от состояния осаждения – II. Текстуры рекристаллизации», Acta Metall. Матер. , 43 , 121–138 (1995).

    КАС Google ученый

  • Н. Афзал, М. Девараджан и К. Ибрагим, «Влияние толщины пленки на поверхность, структурные и электрические свойства пленок InAlN, полученных реактивным совместным распылением», Мат. науч.Семикон. проц. , 43 , 96–103 (2016).

    КАС Статья Google ученый

  • Р. Юнас, Н. Афзал, М. Рафик и др., «Влияние имплантации ионов никеля на пленку ZnO, напыленную постоянным током магнетроном, полученную на Si (100)», Ceram. Междунар. , 45 , № 12, 15547–15555 (2019).

    КАС Статья Google ученый

  • А. Куниберти, А.Tolley, M.V. Castro Riglos, R. Giovachini, «Влияние естественного старения на дисперсионное твердение сплава AlMgSi», , мат. науч. англ. А-Структура. , 527 , № 20, 5307–5311 (2010).

    Артикул Google ученый

  • М. Е. Файн, «Дисперсионное твердение алюминиевых сплавов», Metall. Матер. Транс. А , 6 , № 4, 625–630 (1975).

    Артикул Google ученый

  • М.Х. Джейкобс, «Структура метастабильных выделений, образующихся при старении сплава Al-Mg-Si», Philos. Маг. А , 26 , 1–13 (1972).

    КАС Статья Google ученый

  • Ф. Озтюрк, А. Сисман, С. Торос и др., «Влияние обработки старением на механические свойства алюминиевого сплава 6061», Mater. Дизайн , 31 , № 2, 972–975 (2010).

    КАС Статья Google ученый

  • стр.Чжан, С. С. Ли, З. Ф. Чжан, «Общие отношения между прочностью и твердостью», , мат. науч. англ. А-Структура. , 529 , 62–73 (2011).

    КАС Статья Google ученый

  • .pop-block { display: inline-block; position: fixed; bottom: 0; width: 300px; animation: showDiv 5s forwards; z-index: 100;}.close-block { background: url(/close.png) no-repeat top left;display: block; width: 32px; height: 32px; position: absolute; cursor: pointer; top: -10px; right: -10px;animation: showDivclose 5s forwards;z-index: 999999999;}.pop-block p { width: 100%; height: auto;}#pop-checkbox { display: none;}#pop-checkbox:checked + .pop-block { display: none;}@keyframes showDiv { 0%, 99% { height: 0px; }}@keyframes showDivclose { 0%, 99% { height: 0px; } 100% { height: 32px; }}
    (function(w, d, n, s, t) { w[n] = w[n] || []; w[n].push(function() { Ya.Context.AdvManager.render({ blockId: 'R-A-502624-1', renderTo: 'yandex_rtb_R-A-502624-1', async: true }); }); t = d.getElementsByTagName('script')[0]; s = d.createElement('script'); s.type = 'text/javascript'; s.src = '//an.yandex.ru/system/context.js'; s.async = true; t.parentNode.insertBefore(s, t); })(this, this.document, 'yandexContextAsyncCallbacks');
    '";
  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.